环状RNA（CircRNA）是由前体mRNA外显子的反向剪接产生的共价封闭的单链RNA，最近已成为基因表达调控中的一类重要分子。除了反向剪接连接（BSJ）位点外，环状RNA与其同源线性mRNA共享重叠序列。这一特征使得很难区分环状RNA及其同源mRNA的功能。
2022年7月13号，中科院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲教授在Nature Protocols发表文章Screening circular RNAs with functional potential using the RfxCas13d/BSJ-gRNA system，作者在先前开创性研究的基础上，探讨可编程RNA引导的RNA靶向CRISPR–Cas13（RfxCas13d）系统通过使用BSJ位点上的导向RNA（gRNAs）靶向序列，有效且特异地区分环状RNA和mRNAs，开发并探索了Cas13特异性敲低circRNA的条件。本文描述了基于RfxCas13d/BSJ gRNA系统的详细方案，用于在人类细胞系中进行大规模功能性circRNA筛选。
RfxCas13d敲低环状RNA的优势
RNA靶向VI型CRISPR系统（Cas13a、Cas13b和Cas13d），可直接切割哺乳动物细胞中的单链RNA。Cas13通过适当的引导RNA（gRNAs）被招募到特定的RNA序列，其可以与靶向RNA 形成碱基对。RfxCas13d是circRNA干扰的最佳系统，通过使用跨越BSJ位点的gRNAs靶向序列（BSJ gRNAs），具有最高的干扰效率，并且对其同源mRNA没有可检测的影响。与shRNA及siRNA介导的circRNA敲除相比，RfxCas13d BSJ gRNA系统显示circRNA干扰的更高效率，并具有更高的目标序列保守性，更加依赖非错配的序列配对结合（高特异性，图1）。
图1. RfxCas13d干扰环状RNA的策略
gRNA文库设计和筛选流程
❷将gRNA质粒文库包装到慢病毒中，并用于感染稳定表达RfxCas13d蛋白的相关细胞，以进行功能筛选；
❸30天后，收获细胞，分离其基因组DNA以扩增gRNA文库；
❹筛选分析gRNA分布和识别候选circRNA；
❺ 检测干扰后细胞的功能改变；
注：文库构建应当限制PCR周期（18个以内），避免扩增寡核苷酸文库；最小化细胞生长持续时间，避免文库转化后细胞克隆产生的影响。同时，作者建立Cas13d mediated circRNA screen（CDCscreen）的分选方法，对screen结果进行分选和分析。
图2. BSJ gRNA库设计策略
本文在已有RfxCas13d/BSJ gRNA方法学的基础上，设计高通量gRNA文库，方便对circRNA开展研究。该方案包括gRNA文库的设计、构建和转导、筛选结果分析和功能性circRNA候选的验证，3-4个月即可完成工作。该方案可应用于细胞内和体内，以在未受干扰的条件下或在环境刺激下识别影响细胞生长的高表达环状RNA，而不会干扰其同源线性mRNAs。作者在文末附上了完整的实验方案和流程，并提示了相关的注意细节，对circRNA研究具有重要的参考价值。
图3. RfxCas13d/BSJ gRNA系统进行功能性circRNA筛查的结果