呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是引起婴幼儿和老年人急性下呼吸道疾病的重要病原体。由于呼吸道黏膜是RSV感染的重要部位，在建立系统性免疫的同时增强局部黏膜免疫，对于RSV疫苗开发具有重要意义。然而，目前多数RSV疫苗主要通过肌肉注射产生系统性免疫应答，对呼吸道黏膜免疫的激活相对有限。因此，如何通过合适的递送方式增强呼吸道黏膜免疫，是RSV疫苗研究关注的方向之一。
近日，重庆医科大学基础医学院万雨顺教授与重庆医科大学附属儿童医院刘恩梅教授、臧娜教授团队在Molecular Therapy 在线发表题为 “Intranasal delivery of a vasoactive intestinal peptide-based circRNA vaccine induces systemic and mucosal immunity against RSV in mice”的研究论文。
该研究构建了一种基于血管活性肠肽（VIP）-核衣壳蛋白（N）融合蛋白的受体引导型circRNA鼻内递送平台。该平台利用VIP介导的受体靶向作用促进circRNA在呼吸道相关细胞中的递送，并在小鼠中同时诱导血清IgG、呼吸道IgA及Th1型细胞免疫应答。其中，编码RSV融合前构象F蛋白（Pre-F）的circRNA疫苗表现出较强的中和活性，并对RSV A、B两个亚型均显示出保护作用，为circRNA疫苗的呼吸道黏膜递送及RSV黏膜疫苗开发提供了新的研究思路。
VIP介导受体依赖性内吞
为验证VIP作为circRNA递送模块的可行性，研究团队构建了VIP-EGFP-N融合蛋白，其中VIP作为靶向肽，N蛋白用于结合circRNA，EGFP用于示踪细胞摄取过程。体外实验显示，VIP-EGFP-N可呈浓度依赖性进入细胞，并可被多种细胞摄取，其中16HBE细胞摄取效率最高。同时，该融合蛋白未引起明显细胞毒性或炎症因子表达升高，表现出较好的体外安全性。
进一步机制研究表明，VIP受体VPAC1/VPAC2参与VIP-EGFP-N的细胞进入过程。VIPhyb可显著降低其细胞摄取，而早期内吞抑制剂Dynasore可明显抑制其进入细胞，提示VIP-EGFP-N主要通过VIP受体依赖的早期内吞途径实现细胞摄取，为后续circRNA递送体系的构建提供了基础。
图1. VIP-EGFP-N蛋白递送的细胞穿透特性及其机制评价
VIP-N自组装形成circRNA纳米复合物
为评估VIP-N的circRNA递送能力，研究团队制备了分别编码RSV G(A)、G(B)和Pre-F抗原的circRNA。三种circRNA均具有RNase R耐受性，并可表达相应抗原；在25°C储存14天后，抗原表达水平未见明显下降，表现出较好的室温稳定性。
VIP-N带正电，可与带负电的circRNA通过静电作用自组装形成纳米复合物。当二者摩尔比达到1:70时，复合物Zeta电位由负转正，并呈现较为均一的球形结构。与TAT-N递送体系相比，VIP-N+circRNA在16HBE细胞中诱导的三种抗原表达水平均显著更高，表明VIP-N可形成稳定、均一的circRNA纳米复合物，并促进circRNA递送及抗原表达。
图2. 基于VIP-N的circRNA疫苗的设计与表征
VIP-N circRNA疫苗诱导交叉中和抗体
在完成circRNA纳米复合物的体外构建后，研究团队在BALB/c小鼠中评价VIP-N+circRNA疫苗的免疫原性。剂量优化结果显示，抗原特异性IgG在1–10 μg范围内随剂量增加而升高，20 μg时趋于平台，因此后续采用10 μg进行免疫。初次免疫后，VIP-N+circRNA与TAT-N+circRNA诱导的IgG水平无显著差异；加强免疫后，VIP-N+circRNA诱导的IgG显著升高，其中Pre-F特异性IgG水平整体较高。鼻内给药与肌肉注射产生的血清IgG水平总体相近。
中和实验显示，VIP-N+circRNA-G(A)和G(B)分别表现出针对RSV-A2和RSV-B9320的亚型特异性中和活性，而VIP-N+circRNA-Pre-F对两种RSV亚型均具有较高的中和活性。实验结果表明，VIP-N介导的鼻内circRNA疫苗能够诱导系统性抗体应答，其中Pre-F表现出较好的跨亚型中和能力。
图3. 基于VIP-N的circRNA疫苗诱导强效及交叉中和抗体反应
VIP-N circRNA疫苗诱导Th1偏向免疫应答
为评估疫苗诱导的Th1/Th2免疫偏向及潜在VERD风险，研究团队检测了抗原特异性IgG1和IgG2a水平。结果显示，VIP-N+circRNA诱导的IgG1和IgG2a水平均高于TAT-N+circRNA，且各circRNA疫苗组中IgG2a均显著高于IgG1，提示整体免疫反应呈Th1偏向。
进一步分析发现，与TAT-N+circRNA相比，VIP-N+circRNA诱导了更多IFN-γ⁺ CD4⁺和CD8⁺效应T细胞，且其数量均高于相应的IL-4⁺ T细胞，其中CD8⁺效应T细胞数量高于CD4⁺效应T细胞。结果表明，VIP-N+circRNA疫苗可诱导Th1偏向的免疫应答，并增强IFN-γ相关T细胞反应。
图4. 基于VIP-N的circRNA疫苗诱导Th1偏向的T细胞免疫反应
VIP-N circRNA疫苗增强黏膜IgA应答
在前述系统性免疫应答的基础上，研究团队进一步评价VIP-N+circRNA疫苗的黏膜免疫效果。结果显示，三种VIP-N+circRNA疫苗均可诱导呼吸道黏膜IgA应答，其中Pre-F组水平最高；同时，鼻内给药诱导的IgA整体高于肌肉注射。
进一步分析显示，三种VIP-N+circRNA疫苗均可激活T-bet⁺CXCR5⁺ Tfh1样细胞，且鼻内免疫组的细胞数量显著高于肌肉注射组。表明VIP-N介导的鼻内circRNA疫苗可增强黏膜IgA应答并促进Tfh1样细胞活化，为其抵御RSV呼吸道感染提供了潜在的免疫机制。
图5. 基于VIP-N的circRNA疫苗诱导较强的黏膜IgA应答并激活Tfh1细胞
VIP-N circRNA疫苗提供RSV攻毒保护
为评价疫苗的保护效果，研究团队在加强免疫后对小鼠进行RSV攻毒。与PBS组相比，VIP-N+circRNA疫苗免疫小鼠体重下降较少，肺部病毒负荷明显降低，并伴随肺组织炎症减轻。其中，G(A)和G(B)疫苗分别对相应RSV亚型表现出保护作用；Pre-F疫苗对RSV-A2和RSV-B9320均具有保护效果，其对RSV-A2的病毒载量降低幅度高于G(A)疫苗，而对RSV-B9320的保护效果与G(B)疫苗相当。
进一步检测肺组织细胞因子发现，VIP-N+circRNA疫苗免疫小鼠在攻毒后IFN-γ水平降低，而IL-4未见明显变化。结合肺部病理改善，结果提示VIP-N+circRNA疫苗可降低RSV攻毒后的病毒负荷和肺部炎症，并在该小鼠模型中未表现出明显的Th2相关VERD特征。
图6. 基于VIP-N的circRNA疫苗可保护小鼠抵御RSV攻毒，且未导致VERD
总结
本研究围绕VIP-N介导的circRNA鼻内递送，系统评价了其递送特性、免疫原性及RSV攻毒保护效果。研究结果表明，将VIP受体靶向与circRNA自组装递送相结合，有望在建立系统性免疫的同时增强呼吸道黏膜免疫，为非LNP型RNA疫苗的黏膜递送提供了一种新的探索路径。
目前，该平台仍处于小鼠模型验证阶段，其保护效果、安全性及黏膜免疫机制还需在更具代表性的动物模型中进一步评估。随着递送体系和评价模型的进一步完善，这一策略也为circRNA在呼吸道黏膜疫苗中的应用提供了值得继续探索的方向。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1525001626007069