在合成生物学研究中，基因表达调控是微生物细胞工厂构建的重要环节。细菌mRNA稳定性较低，容易受到内源性核酸酶降解，从而影响蛋白表达水平。因此，如何从RNA层面调控mRNA稳定性成为基因表达调控研究中的重要方向。环状RNA（circular RNA, circRNA）因其闭合结构和较高稳定性受到关注。然而，在细菌体系中实现可控、高效的mRNA环化仍存在一定挑战。
近日，首尔大学Sang Woo Seo团队在Nucleic Acids Research发表题为 “Programmable in vivo mRNA circularization for enhanced gene expression in bacteria” 的研究论文。
该研究开发了一种基于PIE（Permuted Intron–Exon）自剪接机制的体内mRNA环化系统——CRESEnT（Circular RNA Expression for Stable and Enhanced Translation）。该系统能够在细菌细胞内实现mRNA环化，提高转录本稳定性并促进蛋白表达，同时验证了其在多种代谢产物合成途径中的应用。
CRESEnT实现mRNA环化
为验证细菌中mRNA环化的可行性，研究团队基于PIE系统构建了CRESEnT平台，利用来源于T4噬菌体的Td内含子介导RNA末端连接，并引入ECS序列促进剪接环化。同时，构建ECS缺失版本作为线性RNA对照。
在大肠杆菌K-12 MG1655中，CRESEnT表达mCherry后，相比线性对照组荧光信号提高2.68倍。进一步通过ddPCR检测发现，CRESEnT可产生特异性环状RNA信号，环化效率达到26.4%，证明该系统能够在细菌细胞内实现mRNA环化。
图1. CRESEnT系统的构建与验证
CRESEnT系统环化效率
为提高CRESEnT的RNA环化效率，研究团队对UTR长度和split intron间的互补杂交臂进行了优化。结果显示，5′ UTR为35 bp、3′ UTR为24 bp时，RNA环化效率和蛋白表达水平达到较优状态。进一步引入杂交臂后，适当延长其长度可促进内含子互作并提高环化效率，但超过35 bp后效果下降。最终，含30 bp杂交臂的优化构建体使mCherry表达相比线性对照提高5.95倍。上述优化进一步提高了CRESEnT的RNA环化效率和蛋白表达水平，确定了后续实验所采用的优化构建体系。
图2. CRESEnT系统的优化以提高mRNA环化效率
mRNA环化提高RNA稳定性和蛋白表达
在优化CRESEnT系统后，研究团队进一步分析了mRNA环化对RNA丰度、稳定性和蛋白表达的影响。ddPCR检测显示，CRESEnT初始构建体和优化构建体的RNA丰度分别提高2.25倍和3.95倍，表明RNA积累主要与mRNA环化有关。进一步通过利福平抑制转录发现，线性RNA水平持续下降，而环状RNA保持较高稳定性。此外，CRESEnT组单位转录本的蛋白输出提高约1.51倍，说明mRNA环化不仅增强RNA稳定性，也能够提高翻译效率。
CRESEnT适用于不同表达体系
为评估CRESEnT对不同基因表达背景的适用性，研究团队测试了不同启动子和RBS条件下的蛋白表达水平。结果显示，在J23系列启动子和T7启动子体系中，CRESEnT均能提高mCherry表达；在不同强度RBS条件下，CRESEnT同样保持表达增强效果，但弱RBS条件下提升幅度有所降低。研究表明，CRESEnT能够兼容多种转录和翻译调控体系，可作为传统基因表达调控策略的补充。
图3. CRESEnT在不同转录和翻译调控背景下增强蛋白表达
CRESEnT的广泛适用性
为评估CRESEnT的通用性，研究团队测试了不同遗传负载和细菌宿主中的表达效果。将mCherry替换为其他荧光蛋白mTagBFP和sGFP后，CRESEnT均能提高蛋白表达水平，表明其增强作用适用于不同mRNA序列。进一步测试不同长度遗传负载发现，在1371–3543 bp范围内，CRESEnT可使蛋白表达提高1.60–7.29倍。
此外，CRESEnT在多种细菌宿主中均保持表达增强效果，包括大肠杆菌BL21(DE3)、W菌株和Nissle 1917菌株，以及枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌。其中，BL21(DE3)中蛋白表达提高12.24倍。结果表明，CRESEnT能够适用于不同遗传负载和多种细菌宿主体系。
图4. CRESEnT在不同遗传负载和多种细菌宿主中增强基因表达
CRESEnT促进代谢产物合成
在验证CRESEnT增强蛋白表达能力后，研究团队进一步将其应用于代谢工程，测试mRNA环化是否能够提高代谢酶表达并促进产物合成。研究选择flaviolin、itaconate、lycopene和violacein四种代表性代谢产物进行验证。
结果显示，利用CRESEnT调控关键代谢酶表达能够提高多种产物的合成水平。其中，rppA表达增强使flaviolin产量提高2.74倍；cadA调控使itaconate产量提高约1.52倍；crtE调控使lycopene产量提高1.60倍；vioD调控使violacein产量提高1.62倍。
这些结果表明，CRESEnT不仅能够增强单个蛋白表达，还可以应用于不同代谢途径，通过提高关键酶表达改善微生物细胞工厂的代谢产物生产能力。
图5. CRESEnT在代谢产物生产中的应用
总结
本研究开发了基于PIE自剪接机制的细菌体内mRNA环化平台——CRESEnT，实现了对mRNA拓扑结构的可编程调控。该系统通过构建稳定的环状mRNA，改善了细菌中mRNA易降解的问题，并增强了基因表达水平。
不同于传统主要依赖转录和翻译元件调控表达的策略，该研究从RNA结构层面提供了一种新的调控方式。CRESEnT的建立为利用mRNA稳定性调节基因表达提供了新的技术路径，并展示了其在合成生物学和微生物细胞工厂构建中的应用潜力。
原文链接：
https://academic.oup.com/nar/article/54/17/gkag854/8790321?login=false