3月19日，Cell Death & Disease杂志发表了一篇circRNA m6A修饰的文章，报道在下咽鳞状细胞癌中circCUX1携带m6A，直接结合Caspase-1的mRNA 3’-UTR，介导放射耐受。文章的通讯作者是中南大学湘雅医院的唐瑶云教授。
如何找到circCUX1？
为分析下咽林状细胞癌（HPSCC）中差异表达的circRNA，作者从5对HPSCC癌与癌旁标本中通过高通量测序分析差异circRNA。分些得到在HPSCC癌组织中有100种上调的circRNA，53种下调的circRNA。
图1 高通量测序分析HPSCC差异circRNA ）（[1]）
HPSCC中circCUX1表达显著升高，与不良预后有关
选择变化最显著的10个circRNA，在10对HPSCC癌与癌旁标本中进行QPCR验证，结果显示来自CUX1基因4-20外显子的circRNA（circCUX1）在HPSCC中表达升高最显著。头颈部肿瘤（HNSCC）及HOK细胞（人口腔角质细胞）中QPCR检测circCUX1表达，结果表明circCUX1在HPSCC细胞系Fadu中表达最高，总体HNSCC细胞中表达均高于HOK细胞。在78对HPSCC癌与癌旁组织中检测circCUX1表达，分析与放射敏感性的关系，结果显示，放射抵抗的标本中circCUX1显著高于放射敏感组及对照组。生存分析显示，circCUX1高表达的HPSCC预后显著更差。
图2 HPSCC中circCUX1表达显著升高，与不良预后有关（[1]）
circCUX1的鉴定
circCUX1由CUX1基因4-20外显子构成，背靠背引物，RNase R，放线菌素D实验，免疫荧光分析对circCUX1进行了鉴定。结果表明，circCUX1为反向剪切的环状RNA分子，耐受RNase R消化，细胞内circCUX1的半衰期更长。circCUX1主要定位在胞质中。
图3 circCUX1的鉴定（[1]）
circCUX1携带m6A修饰
m6A是研究最多的RNA碱基修饰方式，作者基于meRIP-QPCR分析表明，circCUX1具有m6A修饰，RARA作为阳性对照。Anti-METTL3 RIP捕获了circCUX1，而Anti-METTL14的 RIP实验没有捕捉到circCUX1。Pull-down 后WB检测也验证了METTL3可以结合circCUX1。有趣的是，在干扰METTL3后，circCUX1的表达显著下降，而CUX1母基因mRNA没有明显改变。防线菌素D实验进一步表明，METTL3介导的circCUX1 m6A修饰具有稳定circCUX1的作用。
图4 circCUX1携带m6A修饰（[1]）
干扰circCUX1促进HPSCC放射敏感性
为分析circCUX1在 HPSCC中的功能，作者设计了circCUX1的siRNA。作者发现干扰circCUX1可显著提高HPSCC细胞的放射敏感性，LD50显著降低。并且，即使没有经过放射处理，干扰circCUX1也可以诱导IL-1和IL-18的分泌升高。
图5干扰circCUX1促进HPSCC放射敏感性（[1]）
circCUX1结合并调控Caspase-1 mRNA的表达
文献报道，Caspase-1可以介导IL-1和IL-18的切割和成熟，circCUX1是否调控了Caspase-1的表达？AREsite序列分析显示，circCUX1携带了“UUAUUU”的motif，可以直接与Caspase-1 mRNA 3’-UTR 结合。设计该位点突变的Caspase-1后通过双荧光素酶报告载体检测，结果表明，干扰circCUX1显著促进野生型Caspase-1报告基因表达，但不改变突变型载体。这说明circCUX1具有直接结合并调控Caspase-1 mRNA的功能。RNA Pull-down实验进一步证明了circCUX1与Caspase-1的结合。HPSCC临床标本中qPCR检测表明，放射抵抗的HPSCC标本中Caspase-1表达显著下降，HPSCC标本中Caspase-1表达显著低于对照组。相关性分析结果也表明，Caspase-1的表达与circCUX1呈现显著的负相关性。
图6 circCUX1结合并调控Caspase-1 mRNA的表达（[1]）
HPSCC中circCUX1通过Caspase-1调控放射敏感性
上述结果表明circCUX1可以结合并调控Caspase-1的表达，Caspase-1可以介导IL-1和IL-18的切割和成熟，那么，Caspase-1是否是circCUX1介导的放射抵抗作用的原因呢？为分析这个问题，作者在设计了circCUX1的siRNA的同时，设计了Caspase-1的siRNA。结果表明，干扰circCUX1后IL-1和IL-18的分泌量升高，但同步干扰Caspase-1后，表达恢复到对照组水平。CCK8实验也表明，单独干扰circCUX1后，HPSCC细胞的放射敏感性显著增强（LD50显著降低），而同步干扰Caspase-1后，LD50恢复到对照组水平。
图7 HPSCC中circCUX1通过Caspase-1调控放射敏感性 （[1]）
参考文献：
1. Wu, P., Fang, X., Liu, Y. et al. N6-methyladenosine modification of circCUX1 confers radioresistance of hypopharyngeal squamous cell carcinoma through caspase1 pathway. Cell Death Dis 12, 298 (2021). https://doi.org/10.1038/s41419-021-03558-2