细胞可通过溶酶体途径清除细胞外蛋白和膜蛋白，这一过程已被用于靶向蛋白降解研究。以LYTAC为代表的策略通过利用内源性溶酶体相关受体（LARs），实现对PD-L1、EGFR等肿瘤相关蛋白的内吞与降解。然而，该类体系依赖内源性受体转运，易受受体表达水平、细胞类型及天然配体竞争影响，导致降解效率和持续性受限。因此，开发一种不依赖内源性受体竞争、且具备长效作用能力的可编程蛋白降解系统，成为进一步提升该类技术体内应用潜力的关键。
近日，湖南大学贺建军教授与蒋健晖教授团队在Journal of the American Chemical Society发表研究成果：Synthetic Chimeric Antigen Lysosome-Associated Receptor Redirects Targeted Protein to Degradation。
该研究构建了一种可编程溶酶体降解系统CALAR，通过融合抗原识别模块与溶酶体相关受体结构域，引导PD-L1、EGFR等肿瘤相关蛋白进入溶酶体降解，并减少天然配体竞争的影响。进一步结合circRNA@LNP递送，CALAR可获得更持久的表达与靶蛋白抑制效果，其中PD-L1抑制可维持至7天；在动物模型中，该体系表现出肿瘤生长减缓和免疫细胞浸润增加等效应，为长效、可编程蛋白降解提供了新的实现方式。
CALAR介导绿色荧光蛋白降解
为验证CALAR的可行性，研究以FcRn为骨架构建aGFP-iFcRn受体，实现对可溶性GFP的识别、内吞和溶酶体降解。随后，研究将该策略拓展至ASGPR、M6PR和TfR，均可介导GFP降解，说明CALAR具有一定通用性。机制分析显示，FcRn更偏向回收内体循环；在VEGF实验中，FcRn与M6PR可维持至96小时的蛋白抑制，提示二者更适合作为CALAR的优选骨架。
CALAR内吞作用的研究
为阐明FcRn-CALAR的内吞机制，研究重点分析了aGFP-iFcRn胞内结构域中的LL基序和WW基序。突变实验显示，这些关键位点突变后，受体仍基本保留GFP结合能力，但GFP降解能力明显下降。其中，LL基序突变会显著阻断内吞，使受体主要停留在细胞膜表面，说明其对CALAR介导的内吞过程十分关键。此外，替换FcRn跨膜结构域也会影响受体定位和内吞效率，表明FcRn天然结构域组合对CALAR功能具有重要作用。
图1. 合成的aGFP-iFcRn受体介导的GFP降解的验证
CALAR介导表面蛋白降解
进一步构建aPDL1-iFcRn CALAR系统后，研究在PD-L1-GFP瞬时表达的HEK293T细胞中观察到膜定位GFP信号降低，并在PD-L1过表达HeLa细胞中验证了PD-L1下调。机制上，该过程主要依赖内吞-溶酶体通路，氯喹可逆转降解，而MG132影响不明显；蛋白质组学和TurboID结果也支持其特异性及溶酶体运输机制。
动力学分析显示，aPDL1-iFcRn可在96小时内持续、剂量依赖性抑制PD-L1，并在A549细胞中得到验证。不同LAR骨架比较显示，FcRn体系降解更快、更强，且不受天然配体竞争影响。
图2. 对Calar平台适用性和性能评估
CALAR平台的通用性验证
为评估CALAR的模块化能力，研究构建了aEGFR-iFcRn和aHER2-iFcRn。aEGFR-iFcRn可下调EGFR并抑制EGF诱导的EGFR磷酸化，且呈浓度依赖性、未出现明显“hook effect”；aHER2-iFcRn也可介导HER2降解。同时，aEGFR-iTfR介导的EGFR降解不受转铁蛋白竞争影响。
共表达aPDL1-iTfR和aEGFR-iFcRn可同步降低PD-L1与EGFR，说明CALAR具有正交调控潜力。此外，基于aGFP-iFcRn的按需系统可通过加入GFP融合靶向蛋白，实现特定胞外蛋白的诱导降解。
图3. 对Calar平台的适用性和性能的评估
circRNA驱动CALAR长效降解
研究进一步采用环状RNA编码CALAR，以延长其表达持续性。相比线性RNA，cRNA递送显著增强CALAR表达时间。以PD-L1为靶点时，CR-aPDL1-iFcRn可在HeLa细胞中维持长达7天的PD-L1抑制，并增强人源T细胞介导的细胞毒作用。进一步构建CR-aEGFR-iFcRn后，也实现了更持久的EGFR降解，并抑制HeLa细胞增殖和克隆形成。
图4. 环状RNA编码的CALAR用于抗原降解
CALAR的体内验证
为评估CALAR的体内应用潜力，研究在HeLa荷瘤小鼠中考察LNP递送CR-aEGFR-iFcRn的持续性与分布。结果显示，相比线性RNA，CR-aEGFR-iFcRn在第7天仍保持较强荧光信号，且肿瘤组织信号强于主要器官，提示其具有较好的体内持续性和肿瘤积累。
疗效方面，每7天给药一次的CR-aEGFR-iFcRn对肿瘤生长的抑制效果优于每2天给药一次的LYTAC类对照体系。机制分析显示，各EGFR靶向处理均可降低肿瘤EGFR表达，并伴随Ki67信号下降；安全性评估未观察到明显体重变化或主要脏器损伤，整体耐受性较好。
图5. 环状RNA编码的CALAR的体内评估
CALAR肿瘤免疫治疗的体内评估
在HeLa荷瘤模型中，LNP递送的CR-aPDL1-iFcRn可显著下调肿瘤组织PD-L1表达。随后，在MDA-MB-231荷瘤并回输人源T细胞的NCG小鼠模型中，CR-aPDL1-iFcRn与阳性对照atezolizumab均显著缩小肿瘤体积并降低肿瘤重量，同时降低肿瘤PD-L1表达、增加肿瘤细胞凋亡。两组肿瘤内CD3⁺和CD8⁺ T细胞比例均升高，血清IFN-γ水平增加，提示CR-aPDL1-iFcRn可通过下调PD-L1促进T细胞相关抗肿瘤免疫。
图6. 基于CALAR的肿瘤细胞免疫疗法
总结
本研究系统验证了CALAR作为可编程溶酶体降解平台的可行性，证明其可通过不同抗原识别模块拓展至多种胞外及膜蛋白靶点，并筛选出分选效率较优的FcRn骨架。circRNA@LNP递送进一步提升了系统的持续表达能力，使其更适合长效蛋白调控场景。整体来看，该研究将工程化受体、RNA递送与溶酶体降解结合起来，为肿瘤相关蛋白调控和免疫治疗提供了新的技术路径。
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.6c00107