环状RNA（circRNA）凭借共价闭环结构，具有较高的稳定性和较持久的蛋白表达能力，被认为是RNA治疗领域的重要技术方向之一。然而，现有circRNA平台在进一步转化应用中仍面临多重限制，包括核苷修饰兼容性不足、翻译效率有待提高、免疫原性控制仍需优化，以及应用场景相对集中于疫苗领域等。因此，如何在降低免疫刺激的同时，实现目标蛋白或治疗性短肽的高效、持续表达，成为推动circRNA治疗应用拓展的关键问题。
6月29日，复旦大学璩良研究员团队在 Nature Biomedical Engineering 发表研究论文： “Engineered circular RNA compatible with complete nucleoside modification and rolling circle translation through a Cap-independent translation enhancer”。
该研究通过整合BBV-CITE、体外成环策略与低免疫原性递送系统，提升了circRNA的蛋白表达能力和体内应用可行性，同时进一步降低其免疫原性。研究团队进一步将这一circRNA平台应用于肿瘤疫苗、GLP-1介导的代谢治疗以及自身免疫病免疫耐受等模型，验证了工程化核苷修饰circRNA在多类治疗场景中的应用潜力，表明circRNA有望从疫苗载体进一步拓展为更广泛的RNA治疗平台。
CITE翻译元件的筛选及其与核苷修饰的兼容性
真核mRNA主要依赖5′端m7G帽和3′端polyA尾启动翻译，IRES等帽非依赖机制亦可参与，但circRNA翻译效率受终止密码子等因素限制。为此，研究团队筛选多种CITE序列，发现其长度较短且终止密码子较少。
功能筛选表明，超过三分之二的CITE可在哺乳动物细胞中驱动蛋白表达，其中以BYDV和BBV表现较优，提示CITE可有效启动帽非依赖性翻译。
此外，多种CITE（如BBV、CCFV等）可兼容核苷修饰，部分序列在mo5U修饰后仍维持或增强表达，同时降低炎症因子水平并改善细胞活力，显示其兼具翻译能力与低免疫刺激特性。
图1｜39 nt的BBV元件可有效驱动核苷修饰RNA的翻译，并具有低免疫原性
BBV介导的circRNA滚环翻译
mRNA治疗受限于半衰期较短及蛋白表达持续时间有限，而circRNA在满足核苷酸为3的倍数且无终止密码子的条件下可发生滚环翻译（RCT）。但Tornado系统生成的circRNA中，IRES序列及部分调控元件中的终止密码子会影响RCT效率。
研究团队筛选CITE元件发现，BBV及SCV（PTE）均含终止密码子，需进行序列优化。其中BBV在驱动蛋白表达方面表现较优，但其部分序列与Pol III终止信号相关，对该区域突变可降低翻译效率。在不同组合中，仅U6–BBV体系可实现较明显RCT，而U6–IRES及CMV体系表现较弱或无表达。
质谱与表达分析表明，circRNA可产生串联重复肽，并在较长时间内维持表达。以OVA抗原肽为模型验证，BBV可支持多种蛋白编码circRNA的RCT表达。
图2｜体内生成的含BBV元件circRNA可实现高效滚环翻译
PICC制备无疤痕circRNA
在确认BBV可支持circRNA滚环翻译后，研究团队基于来源于四膜虫的I型内含子设计了PICC自成环系统，用于制备无外源序列残留的circRNA。
实验显示，PICC可在体外生成具有RNase R抗性的circRNA。RT-PCR和测序进一步证实，其连接位点准确，且不含外源插入序列。结构优化结果表明，内部同源臂可提高PICC成环效率，其中35 nt和70 nt效果较好；但同源臂并非必需。即使缺失P10结构，PICC仍可完成RNA环化，支持其用于制备无疤痕circRNA。
PICC成环策略的普适性与RCT验证
研究团队将EGFP、Gaussia luciferase、hEPO和Cre等序列用于PICC体外成环，并与PIE、STS策略比较。结果显示，PICC可实现多种RNA成环，效率高于STS、略低于PIE；其生成的circRNA可在细胞中表达EGFP、Gaussia luciferase和anti-CD19 CAR，表达水平与PIE相当。
免疫原性检测显示，PICC和PIE制备的circRNA均仅诱导较低水平的先天免疫反应。进一步验证表明，含BBV、3×Flag和P2A元件的PICC-circRNA可发生滚环翻译，而替换P2A或BBV后则无法有效RCT。基于此，研究团队进一步实现了OVA257–264及HER2来源E75、GP2等肿瘤抗原短肽的RCT表达，为后续circRNA肿瘤疫苗研究提供了实验基础。
PICC-circRNA肿瘤疫苗体内验证
研究团队利用PICC构建了编码串联OVA表位（OVA257–264和OVA323–339）的BBV-circRNA，并经LNP包封形成circRNA疫苗；同时以编码全长OVA的m1ψ修饰mRNA疫苗作为对照。
在B16F10-OVA荷瘤小鼠中，两种疫苗均可抑制肿瘤生长，其中circRNA疫苗效果更明显，并可增加OVA特异性抗原呈递细胞及CD8+、CD4+ T细胞浸润。RNA-seq结果显示，circRNA疫苗可促进促炎因子表达并激活抗肿瘤免疫相关通路。经HPLC纯化后，circRNA疫苗仍表现出优于线性核苷修饰mRNA疫苗的抗肿瘤效果；在等摩尔条件下，1.8 μg/只circRNA疫苗即可达到与10 μg/只mRNA疫苗相当或更好的治疗效果，提示基于RCT的circRNA平台在治疗性肿瘤疫苗开发中具有较大潜力。
图3｜通过PICC策略体外生成的circRNA可在哺乳动物细胞中实现滚环翻译
Twister核酶构建核苷修饰circRNA
前述实验表明，CITE元件可兼容多种核苷修饰，并支持修饰RNA翻译。由于核苷替换可能影响I型内含子和IRES等关键结构，研究团队转向结构较小的Twister核酶构建核苷修饰circRNA。
结果显示，m5C、hm5C、mo5U、s4U、m1ψ和ψ修饰的Twister核酶仍可发生自切割；其中m5C、hm5C、mo5U、m1ψ和ψ修饰的circRNA可在细胞内精准成环，并实现滚环翻译。免疫原性检测显示，核苷修饰可降低circRNA诱导的免疫反应；小鼠实验进一步表明，m1ψ和mo5U修饰circRNA可降低IFNβ、IFNγ、IL-6和CCL2等炎症因子水平，说明完全核苷修饰有助于降低circRNA免疫原性。
图4｜核苷修饰circRNA可实现高效滚环翻译，并具有低免疫原性
RzL介导核苷修饰circRNA成环
Twister核酶体系生成的核苷修饰RNA入胞前仍为线性状态，需依赖细胞内RtcB连接酶成环。为实现体外成环，研究团队将BBV翻译元件与RzL成环元件结合，并测试多种核苷修饰。
结果显示，mo5U、s4U、m1ψ和ψ修饰会明显影响RzL成环，而m5C和hm5C影响较小。RT-PCR、Sanger测序和Western blot结果表明，m5C和hm5C修饰RNA可精准成环并发生滚环翻译，其中hm5C修饰circRNA的蛋白表达水平与未修饰circRNA相当，说明BBV与RzL组合可用于构建保留滚环翻译能力的体外成环核苷修饰circRNA。
核苷修饰降低RzL-circRNA免疫原性
研究团队评估了核苷修饰对RzL-circRNA免疫原性的影响。RT-qPCR和RNA-seq结果显示，核苷修饰circRNA可降低A549、HeLa及人原代T细胞中的促炎因子、趋化因子和先天免疫信号通路激活。
小鼠实验进一步表明，hm5C修饰circRNA可降低血清IFNγ、IL-6、IFNβ和CCL2水平。在MC38-OVA肿瘤模型中，hm5C修饰circRNA-OVApeptide疫苗较未修饰circRNA疫苗和核苷修饰mRNA疫苗表现出更好的抑瘤效果；等摩尔剂量下，2.37 μg circRNA疫苗可达到与10 μg mRNA疫苗相当的治疗效果。总体而言，核苷修饰circRNA在保留RCT能力的同时降低了免疫原性，并增强了circRNA疫苗的抗肿瘤活性。
图5｜完全核苷修饰降低了RzL成环circRNA的免疫原性
circRNA-GLP-1用于代谢治疗
研究团队构建了编码GLP-1的核苷修饰circRNA，以探索其在疫苗之外的治疗应用。结果显示，该circRNA可产生分泌型GLP-1肽，并在小鼠葡萄糖耐量实验中改善血糖控制，效果优于未修饰circRNA，且与司美格鲁肽相当。
在高脂饮食诱导的肥胖小鼠中，核苷修饰circRNA-GLP-1可部分恢复葡萄糖耐量，降低随机血糖、空腹血糖、血清瘦素和ALT水平，并减轻肝损伤。
上述结果表明，核苷修饰circRNA不仅可用于疫苗开发，也可拓展至代谢疾病相关的蛋白/多肽替代治疗场景。
图6｜完全核苷修饰的circRNA-GLP-1可控制小鼠血糖水平
核苷修饰circRNA诱导自身免疫耐受
研究团队在MOG35–55诱导的EAE小鼠模型中，通过静脉注射递送编码MOG35–55抗原肽的核苷修饰circRNA。结果显示，该处理较未修饰circRNA明显缓解EAE症状，并提高脾脏Treg和PD-1+ CD4+ T细胞比例。
同时，核苷修饰circRNA-MOG35–55减少了脑和脊髓中CD45+免疫细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及活化CD69+ CD4+ T细胞浸润，并降低中枢神经系统中产生IFNγ和IL-17A的促炎CD4+ T细胞比例。
组织病理学结果进一步显示，该处理可减轻脊髓脱髓鞘和脑组织CD4+ T细胞浸润，提示低免疫原性核苷修饰circRNA可通过诱导抗原特异性免疫耐受缓解EAE进展。总体来看，核苷修饰circRNA为自身免疫疾病的抗原特异性免疫耐受治疗提供了新的RNA干预思路。
图7｜完全核苷修饰的circRNA-MOG可缓解EAE小鼠疾病进展
EASY低免疫原性RNA递送平台
为降低RNA递送过程中的免疫刺激，研究团队开发了胞外类病毒颗粒递送平台EASY。该系统通过VSVG、EPM、EABR、intein和MCP等模块，包装并递送带有MS2适配体的mRNA或circRNA。
实验显示，EASY可形成囊泡样纳米颗粒，并有效递送EGFP mRNA及编码Flag或MOG35–55的circRNA，支持circRNA在细胞内发生滚环翻译。体内实验表明，EASY可实现RNA表达，且诱导的促炎因子水平低于lipofectamine或LNP递送。EAE模型中，EASY-circRNA-MOG可改善疾病症状，提示其具有低免疫原性RNA递送潜力。
图8｜EPM–EABR辅助的胞外囊泡递送circRNA可在哺乳动物细胞中实现滚环翻译
总结
本研究围绕circRNA治疗转化中的翻译效率、成环制备、免疫原性和体内递送等核心问题，构建了一套较为完整的工程化优化体系。通过CITE元件筛选、无疤痕成环策略、核苷修饰和低免疫原性递送平台的整合，研究团队显著提升了circRNA作为治疗载体的可设计性和应用可行性。
这一工作不仅拓展了circRNA在肿瘤疫苗、蛋白/多肽替代治疗和自身免疫疾病干预中的应用边界，也表明工程化circRNA有望发展为一种可编程、长效、低免疫刺激的新型RNA治疗平台。随着相关元件、制备工艺和递送系统的进一步优化，circRNA技术在未来RNA药物开发中具有广阔的转化潜力。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41551-026-01725-4