2021年2月18日,广东医科大学徐军发教授和美国University of Illinois College of Medicine的Zheng W. Chen教授作为通讯作者在Clinical & Translational Immunology杂志上发表了一篇题为“Circular RNA TRAPPC6B inhibits intracellular Mycobacterium tuberculosis growth while inducing autophagy in macrophages by targeting microRNA-874-3p”的文章,揭示了环状RNA TRAPPC6B通过靶向miR-874-3p调控巨噬细胞自噬,发挥抗结核固有免疫的功能。

 

研究背景

结核是由结核分枝杆菌经呼吸道感染的一种慢性传染病,由于耐多药结核菌的广泛流行,传统的抗结核化疗对控制结核效果不佳。近年来,宿主导入治疗由于不受细菌耐药性的影响而得到广泛的关注。巨噬细胞自噬被认为是宿主导入治疗的理想靶点。然而,巨噬细胞自噬的调控机制仍不清楚。作者前期研究发现,结核病患者PBMCs中存在大量下调的circRNAs。circRNA是一类非编码RNA,其在多种人类疾病包括肿瘤、神经系统疾病、心血管疾病和炎症相关性疾病中发挥重要调控功能。然而,尚未有circRNA调控结核菌感染巨噬细胞自噬报道。因此,作者通过对结核病患者PBMCs中下调的circTRAPPC6B进行深入研究,以期进一步剖析circRNA在结核菌感染巨噬细胞自噬中的调控机制,寻找宿主导入治疗的精确靶点。

1 circTRAPPC6B在活动性肺结核患者PBMCs和结核菌感染的单核/巨噬细胞中显著下调

对32例活动性肺结核患者和31例健康体检者PBMCs分析发现circTRAPPC6B表达显著下调,且经过1个月的标准化治疗后,circTRAPPC6B在PBMCs的表达显著上调。在人原代单核细胞和THP-1诱导的巨噬细胞中,经结核菌刺激后,circTRAPPC6B的表达也显著下调。

2 circTRAPPC6B主要定位于巨噬细胞胞质

circTRAPPC6B能够耐受RNase R处理,而其线性转录本不能。THP-1源巨噬细胞经核质分离后检测结果示circTRAPPC6B主要分布于细胞质,有意思的是其线性转录本主要存在于细胞核。FISH实验也证明circTRAPPPC6B主要分布于胞质。

 

3 circTRAPPC6B抑制巨噬细胞内结核菌的生长和活化结核菌感染巨噬细胞自噬

THP-1源巨噬细胞和Macaque脾原代巨噬细胞中过表达circTRAPPC6B,分别用结核菌感染3d和7d,CFU计数胞内结核菌数量。结果表明,过表达circTRAPPC6B显著抑制巨噬细胞内结核菌的生长。THP-1源巨噬细胞中分别敲低和过表达circTRAPPC6B,分析其对结核菌感染巨噬细胞自噬的影响。结果显示,干扰circTRAPPC6B可以显著抑制巨噬细胞自噬,过表达circTRAPPC6B显著促进巨噬细胞自噬。Cofocol分析也证明了这一结果。

 

4 circTRAPPC6B靶向miR-874-3p

通过circinteractome,miRDB和RegRNA2三个工具预测分析表明miR-874-3p是circTRAPPC6B可能结合的miRNA。FISH分析发现circTRAPPC6B和miR-874-3p主要分布于巨噬细胞胞质,且存在共定位。双荧光素酶报告基因检测,RNA pull down实验分析进一步确认了circTRAPPC6B和miR-874-3p的结合。

 

5 miR-874-3p促进巨噬细胞内结核菌生长而抑制结核菌感染巨噬细胞自噬

活动性肺结核患者样本证明在PBMCs中miR-874-3p表达上调,且与circTRAPPC6B的表达呈负相关。在结核菌感染的THP-1源巨噬细胞中miR-874-3p的表达也上调。THP-1源巨噬细胞和Macaque脾巨噬细胞中分别转染miR-874-3p inhibitor,结核菌的生长明显被抑制。THP-1源巨噬细胞中分别转染miR-874-3p mimic和inhibitor,分析其对结核菌感染巨噬细胞自噬的影响。结果显示,miR-874-3p mimic可以显著抑制巨噬细胞自噬,miR-874-3p inhibitor显著促进巨噬细胞自噬。Cofocol分析也证明了这一结果。

 

6 circTRAPPC6B通过miR-874-3p/ATG16L1调控结核菌感染巨噬细胞自噬

利用功能回复实验证明circTRAPPC6B通过靶向miR-874-3p调控结核菌感染巨噬细胞自噬。Western blot和免疫荧光结果均说明了circTRAPPC6B靶向miR-874-3p调控巨噬细胞自噬。进一步去研究miR-874-3p调控巨噬细胞自噬的机制,首先利用TargetScan,miRanda和MiRDB三个工具预测其下游靶mRNA,结果显示自噬相关蛋白ATG16L1 3’-UTR区域存在其结合位点。双荧光素酶报告基因实验证明二者存在相互作用。在THP-1源巨噬细胞中分别转染miR-874-3p mimic和inhibitor,western blot结果显示miR-874-3p mimic能够显著抑制ATG16L1蛋白的表达,反之亦然。在THP-1源巨噬细胞中分别过表达和敲低circTRAPPC6B,western blot结果显示circTRAPPC6B的过表达显著促进ATG16L1蛋白的表达,反之亦然。活动性肺结核患者样本证明在PBMCs中ATG16L1 mRNA表达下调,且与circTRAPPC6B的表达呈正相关,与miR-874-3p的表达呈负相关。综合以上实验,说明circTRAPPC6B通过miR-874-3p/ATG16L1调控结核菌感染巨噬细胞自噬。

 

 

7 circTRAPPC6B功能机制汇总

结核菌感染巨噬细胞后通过诱导circTRAPPC6B表达下调,从而促进miR-874-3p对其靶基因ATG16L1的作用,抑制ATG16L1蛋白的表达,从而抑制ATG16L1-ATG12-ATG5复合物的形成,最终导致自噬小体形成受损,抑制自噬从而逃逸巨噬细胞的免疫杀伤。体外过表达circTRAPPC6B能够促进自噬并有效抑制结核菌在巨噬细胞内生长。

 

参考文献

1. Luo HL, Pi J, Zhang JA, Yang EZ, Xu H, Luo H, Shen L, Peng Y, Liu GB, Song CM, Li KY, Wu XJ, Zheng BY, Shen HB, Chen ZW, Xu JF. Circular RNA TRAPPC6B inhibits intracellular Mycobacterium tuberculosis growth while inducing autophagy in macrophages by targeting microRNA-874-3p. Clin Transl Immunology 2021 Feb 18;10(2):e1254.

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