最近发表在JOURNAL OF NEUROSCIENCE期刊(IF=6.074)上的一篇circRNA与脑缺血后再灌注损伤有关的研究论文,报道了circTLK1表达在小鼠脑局部缺血和再灌注后明显上调,其通过海绵miR-335-3p并抑制miR-335-3p活性,继而上调TIPARP基因表达,增加梗死面积,加重神经元损伤和神经功能缺陷的症状。通讯作者是来自东南大学医学院药理学系的姚红红教授姚红红教授是今年第五届circRNA研究论坛的特邀嘉宾,一直关注和从事circRNA与神经炎性相关神经系统疾病的关系研究,欢迎大家踊跃参加。

敲低circTLK1表达减少缺血后脑梗死面积

作者通过在建立短暂的大脑中动脉闭塞小鼠模型tMCAO后,对比假手术组和缺血梗死组的组织中circRNA表达谱差异,筛选出缺血梗死组组织中表达上调水平较高的circTLK1。RT-qPCR验证发现circTLK1在小鼠众多器官中表达,尤其在脑、脾和肺的表达水平较高。同时在小鼠血浆和梗死同侧皮质中发现表达上调的circTLK1,而TLK1 mRNA和蛋白水平却出现下降。为了研究circTLK1在缺血性中风疾病过程起什么作用,作者构建circTLK1 shRNA慢病毒载体注射到小鼠侧脑室,IF验证病毒转染神经元成功,RT-qPCR验证体内敲低效果明显,3周后在小鼠身上建立tMCAO缺血再灌注模型,结果显示敲低circTLK1表达虽然不影响到脑血流量和缺血面积,但是会明显减轻神经功能缺陷症状(表现为神经系统缺陷评分降低),减少缺血再灌注后脑梗死体积。

敲低circTLK1表达减轻缺血后神经功能缺陷的症状

为了详细评估circTLK1对于小鼠中风后神经功能缺陷的影响,作者采用三个实验(神经系统缺陷评分、粘合剂去除试验和圆筒试验)进行评估tMCAO后第0, 3天和7天小鼠的早期症状。体内敲低circTLK1表达可明显减轻tMCAO后神经功能缺陷的症状(神经系统缺陷评分降低)和改善躯体感觉功能(粘合剂去除试验和圆筒试验)。而且敲低circTLK1表达可以明显减轻由tMCAO导致凋亡相关蛋白Bax/Bcl-xl和caspase-3/pro caspase-3比例上调的情况。

接着在评估tMCAO后第0, 14, 21和28天小鼠的晚期症状,发现敲低circTLK1表达依然可以改善tMCAO后神经功能缺陷的症状和改善躯体感觉功能,同时还可以减轻第28天脑萎缩的情况,增加梗死周边皮质的树突复杂性和树突棘的数目,rescue原本由tMCAO导致突触蛋白synapsin-1和PSD95蛋白水平下调的情况。

敲低circTLK1表达减轻脑中风导致的神经元损伤

在脑部众多细胞中,原代皮质神经元细胞中circTLK1的表达水平较高。神经元细胞经缺氧无糖后再灌注(OGD/R)处理模拟体内缺血再灌注后,circTLK1的表达水平明显上调,而TLK1 mRNA表达水平则下调。体外转染circTLK1 shRNA慢病毒可明显并特异地敲低circTLK1的表达,但不影响TLK1 mRNA表达。OGD/R处理可促进神经元细胞死亡,而同时敲低circTLK1表达则促进其存活。WB实验也证明了敲低circTLK1表达可明显降低Bax/Bcl-xl和caspase-3/pro caspase-3比例。

为了评估敲低circTLK1表达对于突触蛋白synapsin-1和PSD95的影响,转染circTLK1 shRNA可以明显上调OGD/R处理后神经元细胞中synapsin-1和PSD95蛋白水平,维持神经元marker– MAP-2水平和神经元突起的长度,保持轴突的长度和树突棘的数目,这些提示敲低circTLK1的表达对于神经元功能的维持和保护有重要的意义。

在神经元中特异性敲低circTLK1可有效保护神经元

作者构建含circTLK1 shRNA序列的腺病毒,注射到小鼠侧脑室,特异性敲低神经元circTLK1的表达,用于动态观察circTLK1在脑中风发生过程中的作用。特异性敲低神经元circTLK1的表达,虽然不影响到脑血流量和缺血面积,但是会明显减轻tMCAO后第3, 7天的神经功能缺陷症状和改善躯体感觉功能。

通过观察tMCAO后第14, 21和28天小鼠晚期症状,发现敲低神经元circTLK1的表达可明显减轻脑萎缩的症状,还可以改善神经功能缺陷症状和躯体感觉功能,进一步提示敲低神经元circTLK1的表达对于中风早期和晚期的重要保护意义

敲低circTLK1表达保护神经元的机制是什么?

通过对比tMCAO组和假手术组的小鼠脑组织mRNA表达谱,发现脑梗死区域和周边区域的TIPARP mRNA水平明显下调。已有研究报道过,TIPARP参与缺血性脑损伤的发生过程。下一步作者通过数据库寻求靶向TIPARP和circTLK1的miRNAs,只有miR-335-3p, miR-320-3p 和miR-129-5p这三个候选分子。而经tMCAO后6h后缺血皮质中miR-335-3p的表达水平是明显下调的。那miR-335-3p与circTLK1是否存在结合作用呢?RNA-pull down证明miR-335-3p可以富集并结合circTLK1;而反向亲和分离实验证明circTLK1也可捕获并富集miR-335-3p。FISH实验证明miR-335-3p与circTLK1共定位于原代皮质神经元的胞浆中。

另一方面,那miR-335-3p与TIPARP是否存在结合作用呢?经数据库预测TIPARP mRNA 3’-UTR区域包含miR-335-3p结合位点。同时luciferase报告基因实验证明miR-335-3p与TIPARP 3’-UTR存在相互结合作用。体内实验发现经tMCAO处理12h 至第7天,缺血组织中TIPARP水平明显上调。经OGD/R处理后 ,皮质原代神经元中TIPARP表达水平也明显上调。另外,无论是否给予OGD/R处理,同时过表达miR-335-3p时,神经元中TIPARP表达水平则明显下调;当抑制miR-335-3p表达时,则出现相反的结果。这些结果提示circTLK1/miR-335-3p/TIPARP调控轴的存在。

circTLK1/miR-335-3p/TIPARP轴对于神经元损伤的意义

OGD/R处理可以促进神经元的死亡,同时过表达miR-335-3p则会维持神经元的存活,这可能与上调突触相关蛋白synapsin-1 和PSD95表达有关 ;而同时抑制miR-335-3p表达则无法维持其存活,这可能与synapsin-1 和PSD95表达下调有关。敲低circTLK1表达可明显抑制由OGD/R处理引起上调的TIPARP蛋白水平。敲低circTLK1表达可下调TIPARP蛋白水平,维持神经元存活的效应,会被anti-miR-335-3p处理所逆转,进一步说明circTLK1通过miR-335-3p调控TIPARP的表达。另外,敲低TIPARP表达会明显维持经OGD/R处理的神经元存活。体内实验也证明,tMCAO小鼠在敲低circTLK1表达后,脑组织中的TIPARP的表达也出现明显下调。

敲低miR-335-3p表达下调PSD95蛋白水平和降低树突棘密度的效应,会被敲低circTLK1表达所逆转。另外敲低TIPARP表达可逆转OGD/R处理所诱导PSD95蛋白下调的效应。体外OGD/R模型的基础上利用rescue实验验证circTLK1/miR-335-3p/TIPARP轴的相互调控关系

在神经元中特异性敲低TIPARP表达可有效改善神经系统缺陷

构建含TIPARP shRNA序列的腺病毒注射入小鼠侧脑室28天后,在神经元中TIPARP表达可被特异性敲低。接着诱导tMCAO后,发现脑血流量和缺血面积不受影响,但是脑梗死体积明显减少,神经系统缺陷评分和躯体感觉功能得到明显改善。

经过长期观察(tMCAO后第28天),TIPARP敲低组小鼠脑萎缩的情况得到明显的改善,神经系统评分和躯体感觉功能也得到明显改善。原本在tMCAO后突触相关蛋白synapsin-1 和PSD95表达下调的情况,在同时敲低TIPARP表达后,这两种蛋白出现明显上调。

CircTLK1的临床意义是什么?

相比于健康人群,患有急性缺血性中风AIS的病人血浆中circTLK1表达水平出现明显上调。AIS疾病分为大动脉粥样硬化LA, 小动脉阻塞SA, 和心源性栓塞CE三种亚型,而只有LA和SA亚型患者血浆中circTLK1表达水平出现明显上调。通过对比发生中风的不同部位,发现只有患有皮质和皮质下梗死的患者血浆中circTLK1表达水平出现明显上调。ROC曲线分析显示circTLK1可能作为临床诊断AIS和提示AIS严重程度的重要标志物,而且AIS患者发生梗死面积越大,其circTLK1表达水平越高。

总结:作者通过对比正常脑组织,从tMCAO小鼠脑组织circRNA表达谱中筛选到表达上调程度相对高的circTLK1,首先从宏观表型分析,敲低circTLK1减少脑梗死面积,改善神经系统功能缺陷和减轻神经元损伤;接着微观机制研究,从tMCAO小鼠脑组织中筛选到已有研究报道过的TIPARP基因,再经生信分析预测并验证TIPARP和circTLK1两者之间的介导者—miR-335-3p。然后通过体外OGD/R证实circTLK1/miR-335-3p/TIPARP轴的相互调控对于保护神经元、改善神经系统功能缺陷的重要意义。最后回归临床,数据统计分析circTLK1有可能作为提示AIS严重程度的重要指标。总的来说,靶向敲低circTLK1和TIPARP表达、过表达miR-335-3p有助于改善AIS引起的神经系统缺陷症状和保护神经元不受损伤。这是少有的circRNA在神经系统疾病方面的研究,如果课题研究有关神经系统疾病方面,可借鉴本文的研究方法。

参考文献

  1. Wu F , Han B , Wu S, et al. Circular RNA TLK1 aggravates neuronal injury and neurological deficits after ischemic stroke via miR-335-3p/TIPARP. J Neurosci. 2019 Jul 16. pii: 0299-19. doi: 10.1523/JNEUROSCI.0299-19.2019.(解读用图均来自此文献)

 

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