图片摘要：circTLK1通过miR-136-5p/CBX4轴促进肾癌的增殖和转移
2020年6月5日，北京大学深圳医院的桂耀庭、喻晶和Jianfa Li为共通讯作者在Molecular Cancer（IF=10.679）杂志上发表了一篇题为“CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p”的文章，阐述circTLK1作为一种癌基因，在肾癌中高表达并通过miR-136-5p/CBX4途径促进肾癌进展。在临床上circTLK1水平与癌细胞转移和预后不良呈正相关，并可作为肾癌的诊断分子和治疗靶点（[1]）。
肾细胞癌(RCC)是泌尿系肿瘤患者的第二大死因，多数患者首次诊断时即为晚期肾癌，它的治疗效果并不显著，术后还经常伴随复发和转移，导致全球肾癌死亡率在逐年上升。因此，迫切需要阐明RCC的发病机制，并开发出有效的治疗方法。环状RNA(circRNA)作为一种新型非编码RNA(ncRNA)，越来越多的证据表明它作为肿瘤发生发展的关键调节因子，并可能成为潜在的生物标志物。然而，circRNA在RCC中的确切功能仍不清楚。在本篇文章中，作者主要探索RCC相关的circRNA及其功能机制和临床应用。
1 RCC组织中高表达的circTLK1可作为RCC的预后分子
为了探索circRNA在RCC中的表达谱，使用RNA-seq技术在正常肾上皮细胞（293-T）和RCC细胞（ACHN、786-O和769-P）中检测到7335 种差异表达的circRNA，其中1919种circRNA被上调，5416种circRNA被下调。在60对RCC组织样本中，circTLK1（hsa_circ_0004442）是所有候选基因中上调幅度最大的circRNA。qPCR验证到circTLK1不仅在RCC组织中过表达，在术后转移的肾癌患者中也存在过表达。另外，circTLK1表达与RCC患者总生存率和无病生存率呈负相关，提示circTLK1可以作为肿瘤的预后标志物。
CircBase数据库和测序分析，证实circTLK1来自TLK1基因的外显子9和10，是含247 nt的环形转录本。为了验证circTLK1的环状RNA特征，设计并合成特异性发散引物在cDNA中扩增circTLK1，产物进行Sanger测序证明反向剪接的存在。使用RNase R处理，来证明circTLK1对RNase R的抗性。
图1 RCC组织中高表达的circTLK1可作为RCC的预后分子
2 敲低circTLK1会抑制RCC细胞增殖、侵袭和迁移
为了确定circTLK1在RCC中的病理功能，设计并合成靶向circTLK1的shRNA，转染到三个不同的RCC细胞系中，敲低效率使用qPCR证实。然后探索circTLK1对RCC细胞增殖、侵袭和迁移的影响。CCK-8和集落形成实验表明，敲低circTLK1会抑制RCC细胞增殖。划痕实验和transwell分析表明，敲低circTLK1可显着降低RCC细胞的侵袭和迁移能力。基于circTLK1在RCC细胞迁移和侵袭中的作用，作者怀疑circTLK1可以介导RCC细胞的上皮-间质转化（EMT）。使用Western blot和免疫荧光实验检测EMT相关的标志蛋白，结果表明敲低circTLK1会导致间充质标记的N-钙粘蛋白和波形蛋白表达显着降低，上皮标记的E-钙粘蛋白表达增加。以上实验结果，得出circTLK1可以促进RCC细胞增殖、侵袭和迁移，并诱导EMT。
图2 敲低circTLK1可抑制RCC细胞增殖
图3 敲低circTLK1可抑制RCC细胞侵袭和迁移
3 circTLK1可以作为miR-136-5p的海绵分子
为了阐明circTLK1的分子机制，作者进行FISH和核质分离试验以检测circTLK1的亚细胞定位。结果发现circTLK1主要定位于细胞质，这表明circRNA具有作为miRNA海绵的潜力，与miRNA竞争性结合，从而减轻miRNA对下游靶基因的抑制作用。为了验证这一假设，作者使用Circinteractome预测可以与circTLK1相结合的miRNA，选取5个miRNA做进一步研究，包括miR-136-5p、miR-421、miR-659、miR-660-5p和miR-944。RNA pull-down和双萤光素酶报告基因实验证实仅仅miR-136-5p可以与circTLK1直接结合。此外，在RCC细胞中过表达或敲低circTLK1不会影响miR-136-5p的表达，反之miR-136-5p也不会调节circTLK1水平。所有实验表明，circTLK1可以海绵吸附miR-136-5p来发挥作用。
图4 circTLK1可以作为miR-136-5p的海绵分子
4 miR-136-5p通过下调CBX4来抑制RCC的进展
基于circTLK1与miR-136-5p之间的相互作用，作者将探索miR-136-5p在RCC中所扮演的角色。以前有研究表明，miR-136-5p作为一个抑癌分子，可以抑制RCC细胞的增殖、迁移和侵袭。使用TargetScan、miRDB、Starbase和miRTarBase数据库进行生信分析来寻找miR-136-5p的下游靶基因，将这四个数据库的分析结果取交集，选取CBX4、GNAS、LUZP6、MSL2、MTMR4和SOCS7作为miR-136-5p的潜在靶标进行下一步实验。作者对数据集进一步分析表明，miR-136-5p与CBX4表达呈负相关。接下来使用双萤光素酶报告基因实验证实，miR-136-5p可直接与CBX4 mRNA的3’UTR结合并抑制其表达。qPCR和WB实验表明过表达miR-136-5p会抑制CBX4 mRNA和蛋白水平。接下来，检测CBX4在RCC进程中的作用。与正常组织相比，RCC组织中的CBX4被上调，并发现CBX4的表达与肿瘤大小和术后转移呈正相关。此外，生存分析表示高表达CBX4的RCC患者总体生存率较低。
图5 CBX4是miR-136-5p的直接靶标
5 敲低CBX4可抑制RCC细胞的增殖、迁移和侵袭
接下来，作者研究CBX4在RCC细胞表型中的作用。使用shRNA来敲低RCC细胞中的CBX4，CCK-8、集落形成实验、划痕实验和transwell实验结果表明敲低CBX4会抑制RCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。此外，作者在TCGA数据库和本身的数据集中发现，CBX4 mRNA水平与VEGFA mRNA水平呈正相关。实验证明敲低CBX4会抑制VEGFA的mRNA和蛋白水平。
图6 敲低CBX4会抑制RCC细胞的增殖、迁移和侵袭
6 过表达CBX4会逆转敲低circTLK1对细胞增殖和转移的抑制作用
为了探讨circTLK1是否通过调节CBX4的表达来发挥其生物学功能，作者进行了回复试验。敲低circTLK1会显著抑制CBX4的mRNA和蛋白水平。CCK-8、划痕实验、集落形成试验和transwell分析显示，在敲低circTLK1的基础上，过表达CBX4会逆转敲低circTLK1对RCC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。
图7 过表达CBX4会逆转敲低circTLK1对RCC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用
7 在体内，敲低circTLK1会抑制RCC细胞的生长和转移
为了研究circTLK1对体内RCC生长和肺转移的作用，将稳定转染shcircTLK1或shNC的RCC细胞注入裸鼠体内，以建立移植瘤和肺转移裸鼠模型。在移植瘤模型中，转染shcircTLK1细胞产生的肿瘤要小于转染shNC细胞产生的肿瘤。敲低circTLK1可显着抑制肿瘤体积和重量。qPCR和IHC实验表明，敲低circTLK1可抑制Ki67、CBX4和VEGFA的表达。此外，过表达CBX4逆转了敲低circTLK1诱导的细胞生长抑制。在肺转移裸鼠模型中，敲低circTLK1会导致肺转移明显减少。HE染色显示shcircTLK1组的肺肿瘤灶少于shNC组。总之，体内研究表明circTLK1可促进RCC的生长和转移。
图8 在体内敲低circTLK1会抑制RCC细胞的肿瘤发生和肺转移
参考文献：[1] Li J, Huang C, Zou Y, Ye J, Yu J, Gui Y. CircTLK1 promotes the proliferation and metastasis of renal cell carcinoma by sponging miR-136-5p. Mol Cancer. 2020;19(1):103. Published 2020 Jun 5. doi:10.1186/s12943-020-01225-2