大家好！我叫小白，生科院新进研一小师妹[害羞]，来跟大家分(tu)享(cao)一下，新手入门circRNA测序的经验。
想当年我听信了”21世纪是生物的世纪”，一头撞进生物系来，本科学了四年，临毕业时，面对求职大军，一脑热就入了考研大坑。刚从坑里爬出来，才发现前路茫茫。幸好近年来circRNA大热，老板顺利拿下国基，语重心长对我说：小白，好好搞科研，到时候连博士也一起读了吧。真是内流满面[流泪]，自己选的路，跪着也要爬完。
话说，暑假那会儿我傻不拉几的提前来了实验室报道，老板二话不说扔给我一堆英文paper，让我好好研究。那时的我是打了鸡血的，挑灯夜战三天，勉强看出点道道来。我们课题组一直有做疾病相关基因组学方面的研究，但筛选circRNA作为肿瘤标志物是新开的研究方向。半个月后，参加实验室的seminar,老板听完师兄师姐们的汇报之后，突然询问起我对研究方向的看法以及具体的实验思路。唉，又搞突袭，我哆哆嗦嗦地把看过的文献总结了一下，肿瘤标志物的初步筛选一般选择不同分期的肿瘤样本及对照进行RNA高通量测序，然后做差异表达分析，再做验证。不知道是不是我讲得太好，还是老板对我盲目信任，他居然决定收一批样本让我试试。
这是一批肝癌组织样本，8对癌和癌旁组织。拿到样本后，我就开始找二代测序公司。其实我们课题组之前也有做过一些基因测序(非circRNA)，合作的都是权威大牌公司，我心想着做生不如做熟，就从师姐那要来销售的联系方式。销售那边询问我要做什么测序，我说做人的组织样本的RNA-seq，他说是转录组测序吗？我心想转录组肯定也包含了circRNA，就回答是啊。然后那边就给我简单说了生信分析内容，周期，价格等，我一听两千多就能完成一个转录组测序，还挺便宜的嘛，觉得老板一定能批，销售说可以先做份合同看看，我也就同意了。
看到这里有经验的你们肯定知道我踩了个坑，但是当时的我还美滋滋地想等汇报时老板夸我办事效率高，实验进展快。销售没两天就把合同给我拟好了，电子版我发给老板过目，结果老板几天没回复。销售说可以先把样本寄过去，等合同付款了再开展。老板把我叫去办公室的那天，我正好在打包样本。你们没猜错，老板是批了，批得我脸红脖子粗。原来这转录组测序仅仅只是mRNA测序，通过OligodT磁珠捕获带PolyA尾的mRNA进行后续测序分析，这种方法是无法获得我们想要的无polyA结构的非编码RNA及环形RNA的。万幸的是，样本还在。（临床样本，你懂的）
如果说我有啥优点能拿出来说的，那就是情商比较高[害羞]。坑不踩都踩了，还是想想怎么爬起来填坑吧。我先去把近几年相关的文献再仔细研读了一遍，发现不同文章circRNA测序的方法是不一样的，有先去除核糖体RNA后再去线性RNA的纯circRNA测序方案，还有直接去除核糖体RNA后建库测序的全转录测序方案，到底哪种更好更适合我呢？有了先前经验之后，我不敢自己想当然了。从室友那听说隔壁实验室有个叫大强的师兄，研究circRNA两三年了，很是有经验。我当下决定请大强师兄吃个饭（食堂），果然拿到了一手资料。大强师兄强烈推荐我找吉赛生物，他的circRNA过表达载体就是用的他们家的。吉赛生物一直专注于circRNA研究，并于2016年搭建了高通量测序平台。虽然时间不长，但是足够专业，提供“快”、“狠”、“准”的测序服务。服务周期快至30天，全程狠抓质控，准确定位客户分析需求，提供一对一个性化服务。
听了大强师兄的建议，我立马联系了吉赛生物的销售。他们的技术支持给我详细解释了circRNA测序和全转录组测序的异同及优缺点。例如全转录组测序对样本起始量要求较低，100ng以上即可，而circRNA测序建库RNA起始量要求一般在2μg以上；全转录组测序能获得包含mRNA/lncRNA/circRNA在内的更多更全面的信息，且数据质量会更好，mapping率一般在85%以上，而cicrRNA测序数据mapping率会下降30%左右，但可将circular junction reads数提高10倍以上，更适合专注circRNA研究的项目；等等。
鉴于我目前的实验研究处于初筛阶段，除了circRNA也还想看看其他非编码RNA的表达情况，所以选择了全转录组测序方案。不到一个月我就拿到了分析报告，初步挑选了12个circRNA让吉赛生物做qPCR验证，居然有10个验证结果与测序结果一致！简直惊喜得不要不要的。后期还要做过表达和功能验证，我要走的路才刚开始。就先分享到这，希望大家都能实验顺利！（默默转发锦鲤[偷笑]）