大家好，我是老王。
2020新的一年，我打算调整方向，转入热门领域circRNA的研究，看到隔壁实验室前辈大强和小白都在用RNase R，我很是困惑，似乎RNase R是circRNA研究者人手必备的工具。初到江湖的我，新手老王对它还有好多疑问。
于是乎，我找到大强和小白，彻夜长谈，终于在他们的帮助下弄清楚了关于RNase R的这20个疑问。
前辈告诉我：RNase R（Ribonuclease R）是一种来源于大肠杆菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶，可消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA、套索结构或3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子。RNase R常用于基因表达和可变剪切研究，可消化线性RNA以使环形RNA（circRNA）或套索结构RNA（lariat RNA）得到富集。
RNase R消化RNA示意图
1. Total RNA 经RNase R消化后有什么变化？
RNase R可消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA。因此total RNA经RNase R消化后线性RNA的含量和相对比例会明显降低，而circRNA的含量基本不变但相对比例会升高，即经RNase R消化后circRNA会被富集。
2. 如何验证RNase R对total RNA的消化作用？
Total RNA经RNase R消化后进行电泳检测，预期RNase R+组28/18/5S条带变淡或不可见（注意区分RNA降解）。
Total RNA经RNase R消化后进行RT-qPCR检测，线性RNA丰度明显降低，环形RNA丰度基本不变。
3. 如何验证RNase R消化的是线性RNA?
可以通过PCR检测线性RNA(如内参或其他mRNA)的丰度变化, PCR检测应使用高特异性的引物，注意区分circRNAs和mRNAs可能有的同源序列。
参考如下结果：将RNase R加入到total RNA中，消化反应后进行RT-qPCR检测，结果显示RNase R+组β-actin和FGFR2的丰度都明显降低，表明RNase R可消化线性RNA。
4. 如何验证circRNA耐受RNase R的消化?
可以通过PCR（或Northern blot等）检测环形RNA的丰度变化, PCR检测应使用高特异性的引物，注意区分circRNAs和mRNAs可能有的同源序列。
参考如下结果：将RNase R加入到total RNA中，消化反应后进行RT-qPCR检测，结果显示RNase R+组hsa_circ_0007874和has_circ_0006404的丰度基本不变，表明环形RNA耐受RNase R的消化。
5. 消化反应中RNase R使用多少比较合适？
不同参考文章里RNase R的使用量和反应体系都有差别，最常见的是20 μL反应体系，使用比例为1-4 U RNase R/μg RNA，实验中可能需要摸索调整。
6. RNase R消化反应温度和时间设定多少？
RNase R消化一般于37℃进行反应，一般10-30 min即可消化掉大部分线性 RNA，RT-qPCR检测线性RNA丰度有几百倍的降低。也可按需求适当延长消化时间，但不推荐1h以上的消化，因为时间过长可能导致少数耐受力弱的circRNAs被消化。另外检测不同的基因可能也需要摸索反应时间，有的实验室直接用于RT-PCR检测时常用5-15 min消化就能得到很好的结果，线性基因丰度可以降低几十到几百倍，circRNA丰度则基本不变。
7. RNase R消化反应后要不要灭活？
经RNase R消化后直接进行逆转录反应的，推荐在37℃反应结束后保持70℃ 10 min使RNase R灭活（也有65℃ 15min）。如果消化后要进行纯化回收，也可以不做灭活。
8. RNase R消化反应后要不要测定circRNA浓度？
实验中要先对total RNA测量浓度，以计算相应的比例和使用量来进行RNase R消化。消化后的反应液中还有蛋白质、盐离子等成分，直接测量浓度很不准确，可以与对照组中取等体积算作等量。
9. RNase R消化反应后circRNA要不要纯化回收？
经RNase R消化后的RNA可使用苯酚：氯仿：异戊醇（25: 24:1, V: V，溶液最好现配现用，没有试剂也可以Trizol Reagent代替）溶液抽提，再使用乙醇沉淀回收；或者使用RNA纯化柱和磁珠进行纯化回收。经RNase R消化后直接进行RT-PCR的，一般可以不做纯化，酶失活后直接进行逆转录反应即可。
10. 为什么有时RNase R消化结果一致性（重复性）差？
一种可能是加样不准确。RNA或RNase R的用量有偏差，导致内参不齐或者消化程度不一致，因此在同一对比实验中，除了是否加RNase R外，应确保其他所有条件一致。另一种可能是消化反应条件有偏差，反应中尽量同时进行RNase R+和RNase R-组的消化实验，使用相同的反应条件，PCR检测使用同样的条件和引物等。
11. RNase R消化反应失败？
1) 检测mRNA和circRNA丰度都没有明显变化。可能是因为RNase R消化反应体系、PCR检测等有误。实验中应使用配套的Reaction Buffer 配制反应液，可以尝试调整反应体系和条件，额外添加MgCl2（Mg2+终浓度最高0.5 mM）也可以增强反应中RNase R的活性。建议RNase R消化后先取部分进行电泳检测，确认28/18/5S条带变淡或不可见，否则可能是未成功消化。
2) RNase R+组中检测不到circRNA。可能由于circRNA丰度过低未能检测到，或者RNA被外源RNase降解。实验中应使用RNase-Free（DEPC处理）的枪头、离心管和水等耗材试剂。
3) 线性RNA消化不完全。限定反应体系和时间时线性RNA不太可能被彻底消化，但应能检测到线性RNA丰度明显降低。
12. circRNA也会被消化吗？
实验中有时会发现经RNase R消化后部分circRNA丰度也有明显降低，此时要检查消化反应体系有无问题，考虑是否被外源RNA酶降解。另外有些circRNA在经长时间RNase R消化也会丰度降低，可能是因为其耐受RNase R消化力弱。小编做实验时也经常会检测到RNase R消化后circRNA丰度会降低的情况，一般减少RNase R用量或缩短消化时间可以减少circRNA被消化的可能，另外对比线性RNA和circRNA消化后丰度降低的倍数，是明显能看到circRNA比线性RNA耐受消化的。
13. 线性RNA消化不完全正常吗？
实验中经常发现经RNase R消化后做RT-PCR依然能检测到线性RNA的条带，总要怀疑是消化不够彻底或消化体系不合适。但其实这种情况是正常的，因为在限定RNase R用量和反应时间的条件下，底物中线性RNA很难被彻底消化，而增加RNase R用量或反应时间又可能导致部分circRNA被消化，因此在固定体系中平衡反应时间是很有必要的。某些没有3’突出末端的结构化线性RNA（如snRNAs, snoRNAs, Y RNAs） 或含有G-四联体（G-quadruplex） 的线性RNA可能耐受RNase R消化，可以尝试以RPAD（high-puritycircular RNA isolation method） 或组合A-Tailing/LiCl-buffer RNase R消化方法进行调整优化。
另外注意以半定量PCR的思路，统一PCR扩增条件和循环次数，电泳检测也可能得到理想的结果图。如果RNase R消化后circRNA丰度不变或轻微降低（RT-PCR检测条带基本不变），而线性RNA丰度明显降低（RT-PCR检测条带变淡或不可见），这样的结果也是符合预期的。
14. RNase R消化后qPCR内参怎么选择？
内参常使用β-actin或GAPDH，但应把原始的RNA等分为两份，一份进行RNase R处理（RNase R(+)），另一份不处理（RNase R(-)），统一以RNase R(-)组中的内参为计算标准。
另外在RNase R消化后如果进行纯化回收，RNA的浓度/总量可能会有变化，不适宜再以RNase R(-)组中的内参为计算标准。此时可以在消化反应后纯化回收前加入少量其他物种的RNA作为外参，统一以外参标准化样品后进行计算。
15. 一般的RNase抑制剂可以抑制RNase R的活性吗？
有看到文章在RNase R消化体系中添加RNase inhibitor的，估计不会抑制。
16. circRNA做q-PCR 逆转录前RNA是否一定要RNase R消化？
要依据实验目的而定，RNase R更多是用于circRNA的鉴定验证以及富集。如果只是检测样品中circRNA的丰度，且有高特异性的引物，是可以不做RNase R消化的。
17. RNase R消化反应能不能用来验证一个RNA是否是环状RNA？
早期研究报道circRNA比线性RNA耐受RNase R消化，但近年也发现不少线性RNA耐受消化以及circRNA容易被消化的，因此验证circRNA耐受RNase R消化就证明是环状RNA（即必要但不充分条件）也是不严谨的。
所以除了验证环状RNA耐受RNase R消化外（也有可能不耐受消化或结果不理想），还要结合RT-PCR，全长鉴定，junction位点的sanger测序，Northern blot等实验从多维度去验证一个RNA是否是环状RNA。
18. RNase R消化后circRNA的量反而增加了怎么回事？
如果是消化后直接进行RT-qPCR检测，考虑到样品中circRNAs的相对比例会提升，可能导致circRNAs的逆转录和PCR扩增效率提升。另外反应液中残留的Mg2+也可能会增强PCR反应。因此有可能检测到RNase R消化后circRNA的量反而增加。
19. circRNA高通量测序的样品必须要用RNase R消化吗？
高通量测序时常需要对circRNA进行富集，此时RNase R消化就是必须的。为探究RNase R消化后circRNA的富集程度和相关基因的变化，可以同时做RNase R(+)和RNase R(-)组样品的测序。实验室的测序显示RNase R(+)组中junction reads相对于RNase R(-)样本有5-10倍的富集，可鉴定出几千到上万个circRNAs。
20. 隔壁实验室都是从哪儿买到的RNase R？
相比国外进口RNase R，国内生产商吉赛生物的货期比较稳定，实验计划好安排，品质和稳定性非常不错，性价比高，SCI文章中引用的也不少，国际上也很认可，数据显示国内也有200多家实验室在使用。大强和小白的实验室都在用。
我新手老王顿时豁然开朗，不多说了，就从RNase R入手，开启我circRNA研究的大门。
下面是我隔壁实验室前辈大强和小白的两篇circRNA研究心得，一并分享给大家，希望大家和我一起，新的一年实验顺利！
图片链接：为了毕业，我竟然做错了这么多！（去掉文末的促销链接）
circRNA测序的坑，你别踩！