环状RNA（circular RNA，circRNA）因其共价闭环结构，通常较线性mRNA具有更高的稳定性，近年来受到RNA药物领域的持续关注。但与此同时，闭环结构也使circRNA构象更为刚性，对LNP的包封和胞内递送提出了更高要求。传统围绕线性mRNA建立的LNP体系未必能够直接适用于circRNA，因此，如何结合circRNA的结构特点进一步优化递送体系，仍是其体内应用需要解决的重要问题。
近日，日本名古屋大学 Hiroshi Abe和Seigo Kimura 团队在 Cell Biomaterials 发表题为 “A branched ionizable lipid nanoparticle platform for versatile in vivo delivery of nucleic acids: Validation from mRNA to capped circular RNA” 的研究论文。
该研究围绕LNP脂质结构优化，开发了多分支可离子化脂质FL0445，并构建相应的LNP递送体系。研究进一步考察了该体系对不同结构和长度核酸载荷的适配性，重点拓展至Cap-cirRNA，并从配方特征、胞内转运、体内递送及安全性等方面进行了系统评价。
图1. FL0445-LNP：面向下一代RNA治疗的变革性递送平台
分支型LNP的构建与表征
研究团队首先对分支型可离子化脂质FL2266和FL0445及其LNP进行了表征。两者均具有中心胺核心和三个分支，主要区别在于R1和R2支链结构。随后，将其与不同辅助磷脂组合，并与MC3、SM-102和ALC-0315等传统脂质配方进行比较。各LNP整体理化性质相近，为后续评估不同脂质结构和辅助磷脂对递送性能的影响提供了基础。
图2. 脂质结构及LNP的理化性质表征
FL0445-LNP的体外mRNA递送优势
为比较不同LNP的体外mRNA递送性能，研究团队首先在HeLa细胞中进行评估。结果显示，以DOPE为辅助磷脂时，FL2266和FL0445-LNP的mRNA递送效率明显优于传统配方，其中FL0445/DOPE-LNP表现最佳。进一步的EGFP和RAW-Blue细胞实验表明，FL0445-LNP具有较高的转染效率，同时免疫刺激较低。基于这一综合表现，后续实验均采用FL0445/DOPE配方。
图3. 体外mRNA转染效率及免疫原性评估
FL0445-LNP的差异化胞内转运
为解析FL0445-LNP高转染效率的原因，研究团队比较了不同LNP的细胞摄取与胞内转运。尽管FL0445-LNP的细胞摄取量较低，其转染效率却更高。内吞抑制实验显示，其摄取具有明显的能量和胆固醇依赖性；溶酶体共定位未见显著差异，但在无血清、pH 6.0条件下表现出较高的膜扰动活性。结果提示，FL0445-LNP的递送优势可能与其不同的内吞途径及后续胞内过程有关。
图4. FL0445/DOPE-LNP与传统LNP配方的细胞内转运比较
FL0445-LNP的体内递送与分布
研究团队首先筛选出体内mRNA表达最高的FL0445-LNP配方Com 1。静脉给药后，其总体表达与SM-102-LNP和ALC-0315-LNP相近，但在脾脏中的功能性递送相对更高，且主要分布于肝脏、脾脏和肺。在细胞水平上，FL0445-LNP与SM-102-LNP的转染类型整体相似，但前者在肝细胞中的功能性转染比例更高。局部给药时，FL0445-LNP的优势更明显，尤其皮下注射后递送效率提高约3–4倍；肌肉注射后则表现出较低的肝脾暴露和更高的淋巴结富集。
图5. 不同脂质组成及不同给药途径下FL0445-LNP的体内功能性mRNA递送
FL0445-LNP的低炎特征
为评估LNP给药后的组织反应，研究团队对小鼠肝脏和脾脏进行了bulk RNA-seq分析。结果显示，FL0445-LNP与SM-102-LNP均可激活多种免疫相关通路，但FL0445-LNP诱导的免疫和炎症相关基因表达整体更低。与此同时，其吞噬相关基因表达也较低，提示两种LNP可能具有不同的胞内命运。结合此前观察到的胆固醇依赖性摄取特征，FL0445-LNP整体表现出较低的免疫和炎症激活水平。
图6. LNP给药后肝脏和脾脏的转录组响应
FL0445-LNP递送Cap-cirRNA
研究团队进一步将FL0445-LNP用于Cap-cirRNA递送。该设计通过分支型帽结构实现帽依赖翻译，无需引入较长的IRES序列，可构建更短的cirRNA。FL0445-LNP对Cap-cirRNA具有较高的包封效率，在HeLa和JAWSII细胞中的递送效率也明显优于基准LNP。
进一步比较发现，较长的NLuc RNA中线性mRNA表达更高，而较短的HiBiT RNA中Cap-cirRNA更具优势，提示较小RNA载荷更容易体现环化带来的表达优势。结构分析还显示，RNA拓扑和脂质组成会影响LNP形态及相分离行为，但其与递送效率之间的关系仍不明确。
图7. FL0445-LNP对Cap-cirRNA的体外递送
Cap-cirRNA的体内递送与功能验证
研究团队进一步评估了FL0445-LNP对Cap-cirRNA的体内递送能力。静脉给药后，FL0445-LNP对NLuc Cap-cirRNA的递送优于SM-102-LNP。在线性mRNA与Cap-cirRNA的长期表达比较中，静脉给药时线性mRNA具有更高的峰值和2周AUC，而皮下注射后Cap-cirRNA表达更持久，并获得更高的2周AUC，显示出明显的给药途径依赖性。
基于较短Cap-cirRNA在前期研究中的持续表达优势，研究团队进一步采用静脉注射评估GLP-1 Cap-cirRNA。在ob/ob肥胖小鼠中，Cap-cirRNA组在葡萄糖负荷后30 min显著降低血糖，但整体血糖AUC未达到统计学显著性。该结果主要支持FL0445-LNP递送小型治疗性Cap-cirRNA的体内功能性概念验证，而非已确立的抗糖尿病疗效。
图8. 编码NLuc和GLP-1的Cap-cirRNA体内递送
FL0445-LNP的多核酸适配性
在mRNA和Cap-cirRNA之外，研究团队进一步评估了FL0445-LNP对mRNA疫苗、ASO和pDNA的递送能力。OVA mRNA疫苗实验中，FL0445-LNP诱导更强的抗原特异性体液和细胞免疫；在ASO递送中，可有效降低血浆FVII活性，实现肝脏基因沉默；在pDNA递送中，其功能性表达与基准LNP相当，并呈现一定的脾脏偏好性。结果表明，FL0445-LNP对不同类型核酸载荷具有较好的兼容性。
图9. FL0445-LNP在mRNA疫苗及多种核酸载荷递送中的应用：OVA编码mRNA-LNP诱导的抗原特异性免疫反应评估
FL0445-LNP的体内安全性
研究团队通过小鼠单次静脉和皮下给药评估FL0445-LNP的体内安全性。静脉给药后，FL0445-LNP诱导的炎症反应较弱，AST和ALT水平与PBS对照相近。包封Cap-cirRNA后，两种给药途径下同样仅引起较低的细胞因子反应，且未见明显血清生化异常。此外，FL0445-LNP组体重变化与对照组基本一致。结果表明，FL0445-LNP在单次给药条件下具有较好的体内安全性。
图10. FL0445-LNP的体内安全性评价
总结
本研究围绕多分支可离子化脂质FL0445构建了新的LNP递送体系。FL0445-LNP具有较高的递送效率，并在小鼠单次给药中表现出较低的炎症反应和较好的体内耐受性，同时可适配线性mRNA和Cap-cirRNA等不同RNA载荷。
在Cap-cirRNA递送中，该体系在特定给药条件下表现出更持久的表达，并完成了GLP-1 Cap-cirRNA的体内功能性概念验证。除此之外，FL0445-LNP还可用于mRNA疫苗、ASO和pDNA递送，体现出较好的核酸载荷兼容性，为Cap-cirRNA及其他核酸载荷的体内递送提供了新的LNP方案，也为后续拓展更多应用场景提供了基础。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S3050562326002114