环状RNA（circular RNA，circRNA）具有较高的稳定性和持续蛋白表达能力，在RNA治疗领域具有应用潜力。然而，持续表达在带来优势的同时，也对蛋白表达的可控性提出了更高要求。特别是在治疗应用中，如何根据需要调节circRNA的翻译水平，避免功能蛋白持续表达可能带来的不良影响，仍是需要解决的重要问题。因此，在保持circRNA稳定表达优势的基础上，实现对其翻译过程的动态调控，对于拓展circRNA的应用具有重要意义。
近日，湖南大学汪凤林、唐丽娟团队在Analytical Chemistry发表题为 “Circular RNA Translation Modulation via Small Ligand-Mediated Protein Stabilization” 的研究论文。
该研究构建了一种小分子调控的circRNA翻译系统：通过小分子调节RNA结合蛋白（RNA-binding protein，RBP）的稳定性，使其与IRES中的RNA motif结合，进而调控circRNA翻译。该系统具有较大的动态调控范围和剂量依赖性，并进一步用于调节Ras/ERK信号通路和T细胞活化，为circRNA蛋白表达的外源可控调节提供了一种新的实现方式。
小分子介导蛋白稳定化调控circRNA翻译的示意图
构建RBP响应型circRNA翻译调控平台
研究团队首先基于CVB3 IRES构建circRNA翻译体系，并采用Tornado系统促进RNA环化。RT-PCR证实circRNA成功形成，在HEK293T细胞中的环化效率约为70%，且能够有效表达mCherry。
在此基础上，研究团队利用MS2-MCP体系筛选RBP响应位点。结果显示，在CVB3 IRES的domain VI插入2×MS2后调控效果最为明显，共表达MCP可使mCherry荧光降低约128倍，且抑制程度随RBP表达水平升高而增强。
进一步测试发现，Box C/D-L7Ae、EcCBS-Cse3和PP7-PCP等RNA-RBP组合也能不同程度抑制circRNA翻译，表明该策略可拓展至不同的RNA-RBP模块，为后续通过小分子调控RBP稳定性进而控制circRNA翻译奠定了基础。
图1. RBP调控的circRNA翻译系统的设计与表征
小分子稳定RBP实现circRNA翻译抑制
研究团队将MCP与FKBP去稳定结构域（DD）融合，构建小分子响应型circRNA翻译抑制系统。加入Shield-1后，DD-MCP被稳定并与IRES中的MS2 motif结合，从而抑制circRNA翻译，使mCherry荧光降低约54倍。
随着Shield-1浓度升高，mCherry表达逐渐下降；去除Shield-1后，受到抑制的SEAP表达能够恢复，表明该系统具有剂量依赖性和可逆性。此外，ecDHFR-TMP体系也实现了类似调控，说明该策略可拓展至不同的蛋白稳定化模块。
进一步测试显示，EcCBS/DD-Cse3体系同样具有剂量依赖的翻译抑制，而其他RBP组合的响应程度有所不同，进一步体现了该调控体系的可拓展性。
图2. 小分子调控的circRNA翻译抑制系统的表征
小分子诱导circRNA翻译激活
在翻译抑制体系基础上，研究团队进一步将DD-MCP与HCV蛋白酶结合，并引入HCV底物序列，构建小分子诱导的circRNA翻译激活系统。加入HCV蛋白酶抑制剂grazoprevir（GZR）后，原本较低的mCherry荧光明显增强；相比之下，另一种IC₅₀略高的抑制剂产生的荧光增强较弱。
进一步实验显示，随着GZR浓度从1 nM升至1 μM，mCherry荧光逐渐增强，而提高HCV底物的亲和力并未进一步提升激活效率。这些结果表明，研究团队成功建立了小分子诱导的circRNA翻译激活系统。
图3. 小分子调控的circRNA翻译激活系统的设计
调控Ras/ERK信号与T细胞活化
在此基础上，研究团队进一步探索该体系对细胞功能的调节。将mCherry替换为SOS1后，加入Shield-1可抑制SOS1表达，并降低Ras/ERK通路活性；随着Shield-1浓度升高，通路活性进一步下降，表明该体系能够对细胞信号进行剂量依赖性调节。
研究团队随后将这一策略拓展至T细胞活化，通过circRNA表达可同时识别CD3和EGFR的双特异性T细胞连接器（BiTE）。BiTE能够促进Jurkat T细胞与HeLa细胞接近并诱导T细胞活化，而随着Shield-1浓度升高，CD69表达逐渐下降，进一步表明该体系可通过调控功能蛋白表达，实现对细胞功能的动态调节。
图4. 小分子调控的circRNA翻译系统对细胞过程的调节
图5. 小分子调控的circRNA翻译系统对T细胞活化的调节
总结
本研究将小分子响应的蛋白稳定性调控与circRNA翻译相结合，实现了对功能蛋白表达及相关细胞过程的外源调节。相比持续表达模式，该策略为circRNA提供了更加灵活的表达调控方式，也体现了其在不同RNA-RBP及蛋白稳定化模块之间的拓展潜力。目前，该体系主要在细胞水平进行了验证。未来还需进一步通过体内研究评估其调控效果、安全性和应用可行性。
原文链接：
https://pubs.acs.org/ancham/article-abstract/doi/10.1021/acs.analchem.6c03443/5247795/Circular-RNA-Translation-Modulation-via-Small?redirectedFrom=fulltext