犬冠状病毒Ⅱ型（Canine coronavirus type II，CCoV-II）是犬肠道冠状病毒的重要基因型，可引起腹泻等胃肠道症状。CCoV-II的Spike（S）蛋白是病毒入侵宿主细胞及诱导中和抗体应答的关键抗原，但其部分区域具有较高的遗传变异性，给疫苗的抗原设计和保护范围带来挑战。现有疫苗主要采用灭活或减毒病毒等传统技术路线，因此，如何针对流行毒株筛选具有代表性的抗原表位，并兼顾体液免疫和细胞免疫，是CCoV-II新型疫苗开发值得关注的问题。
近日，华中农业大学赵凌团队在 Veterinary Microbiology 发表题为“Design and preclinical evaluation of a multi-epitope circular RNA vaccine targeting the spike protein of canine coronavirus genotype II”的研究论文。
该研究以具有流行代表性的CCoV-II WH2023毒株为基础，通过免疫信息学方法筛选S蛋白中的CTL、HTL和B细胞表位，构建多表位circRNA疫苗（ME-S），并采用脂质纳米颗粒（LNP）进行递送。同时，研究构建了编码全长S蛋白的circRNA疫苗（FL-S）作为对照，并在小鼠和犬模型中对两种候选疫苗的免疫原性、安全性及攻毒保护效果进行了评价。
代表性毒株筛选
为筛选具有代表性的疫苗设计模板，研究团队选择高致病性CCoV-II毒株WH2023。系统发育分析显示，WH2023与近年来主要流行的CCoV-II谱系聚类关系较近，其S蛋白与多个流行株具有较高序列一致性，且S基因未检测到明显重组断点。因此，WH2023被用于后续多表位circRNA疫苗设计。
图1. CCoV-II WH2023毒株的遗传特征及系统发育分析
多表位筛选与设计
为构建能够诱导多层次免疫应答的多表位疫苗，研究团队基于WH2023毒株S蛋白开展免疫信息学筛选，综合MHC结合能力、免疫原性、抗原性及安全性等指标，最终筛选出6个CTL表位、5个HTL表位和8个LBL表位。这些表位均满足相应的抗原性和安全性筛选标准，并分布于S蛋白不同区域，为后续多表位circRNA疫苗的构建提供了候选表位组合。
circRNA-LNP疫苗构建与表征
研究团队将筛选出的CTL、HTL和LBL表位优化组合，构建多表位circRNA（ME-S），并以全长S蛋白circRNA（FL-S）作为对照，分别采用LNP进行包封。两种制剂粒径均约为100 nm，具有较好的均一性和胶体稳定性，并可实现目标抗原的体外表达；ME-S和FL-S circRNA的环化效率分别为85.64%和78.74%。
图2. ME-S和FL-S circRNA-LNP疫苗的设计、表征及体外验证
犬模型验证疫苗安全性
研究团队在犬模型中评估了circRNA-LNP疫苗的安全性。免疫24小时后，ME-S和FL-S组IL-1β、TNF-α水平均显著低于ComVax组，且ME-S组IL-6水平显著低于FL-S和ComVax组。免疫后14天内，犬只体温维持正常，注射部位未见明显组织坏死、慢性炎症浸润或病理损伤。结果表明，circRNA-LNP疫苗具有良好的安全性和生物相容性，其中ME-S表现出更低的炎症反应。
图3. circRNA-LNP疫苗在犬模型中的安全性及生物相容性评价
多表位疫苗增强体液免疫应答
研究团队在小鼠中评价了circRNA-LNP疫苗的免疫原性。结果显示，ME-S和FL-S均可诱导持续的S蛋白特异性IgG和病毒中和抗体（VNA）应答，其中ME-S在免疫早期诱导了更高的S特异性IgG水平，中和抗体也呈现较高趋势。进一步分析发现，两种疫苗均可激活生发中心反应并促进骨髓浆细胞形成，其中ME-S在初次免疫后第7天诱导的GC B细胞比例显著高于FL-S。结果表明，两种circRNA疫苗均可诱导较强的体液免疫，ME-S在早期抗体应答和生发中心启动方面表现出一定优势。
图4. circRNA疫苗在小鼠模型中的体液免疫和细胞免疫原性
犬模型验证免疫原性
研究团队进一步在犬模型中评价circRNA-LNP疫苗的免疫原性。结果显示，ME-S和FL-S均可诱导持续的S蛋白特异性IgG和病毒中和抗体应答，其中ME-S在第2周的IgG和VNA水平显著高于FL-S，此后两组抗体水平相当。同时，免疫后犬外周血中CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞及B细胞比例未发生显著变化。结果表明，两种circRNA-LNP疫苗均可诱导较强的体液免疫并维持外周免疫稳态，ME-S表现出更快的早期免疫应答。
图5. 犬模型中circRNA疫苗的免疫原性及淋巴细胞亚群分析
Th1偏向型细胞免疫应答
研究团队进一步分析了小鼠和犬的细胞免疫反应。结果显示，ME-S和FL-S均可诱导明显的IFN-γ应答，而IL-4应答相对较弱。其中，小鼠IFN-γ水平约为IL-4的5–10倍，表现出以Th1为主、伴轻度Th2的免疫特征；犬模型中IL-4绝对水平较低，Th1偏向更加明显。两种疫苗之间未见显著差异，表明ME-S和FL-S均主要诱导Th1型细胞免疫应答。
图6. 抗原特异性细胞因子分泌及T细胞极化
强毒攻毒验证保护效果
研究团队使用高致病性CCoV-II WH2023毒株对免疫犬进行攻毒。结果显示，与Mock组相比，疫苗组病毒排毒显著降低，且未出现明显临床症状，体温和体重保持稳定。组织病理分析进一步显示，疫苗组犬的空肠和回肠结构保存完整，肠绒毛损伤和炎症浸润明显减轻。总体表明，circRNA疫苗能够显著抑制病毒排毒，并减轻CCoV-II感染引起的临床表现和肠道病理损伤，具有良好的攻毒保护效果。
图7. circRNA疫苗对犬高致病性CCoV-II攻毒的保护效果
总结
本研究将免疫信息学、多表位抗原设计与circRNA-LNP递送技术相结合，构建了靶向CCoV-II S蛋白的多表位circRNA疫苗ME-S。该疫苗在小鼠和犬模型中诱导了较强的体液免疫和Th1偏向型细胞免疫，并在犬强毒攻毒实验中有效降低病毒排毒、减轻临床症状和肠道损伤，表现出良好的保护效果，为circRNA技术在兽用疫苗开发中的应用提供了临床前依据。未来仍需进一步评估其跨毒株保护能力、免疫持久性及实际应用价值。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0378113526003251?via%3Dihub