近年来，circRNA凭借结构稳定、蛋白表达持久及良好的治疗应用潜力，逐渐成为RNA药物领域的重要研究方向。然而，现有核酶介导的体外环化技术仍存在核酶利用率低、底物设计灵活性不足和后续纯化复杂等问题，难以同时满足高效率、低成本和规模化生产的需求。因此，开发更加高效、灵活且易于放大的circRNA合成体系，已成为推动该领域发展的关键。
近日，中国药科大学刘志达教授与中国科学院微生物研究所高福院士、清华大学喻国灿教授以及淄博市中心医院王连庆研究员团队合作，在Nature Communications发表题为”Split intron-exon system for circular RNA synthesis”的研究论文。
该研究开发了一种全新的circRNA体外合成策略——分体式内含子-外显子（Split Intron-Exon，SIE）体系。该体系将核酶与底物RNA物理分离，突破了传统体系中单个核酶通常只能催化生成一个circRNA分子的限制，不仅提高了核酶利用率和设计灵活性，还可高效制备未修饰及化学修饰circRNA。研究进一步通过核酶固定化实现回收与循环利用，减少产物中的核酶污染并简化后续纯化，为circRNA的多样化制备与规模化生产提供了新的技术路径。
SIE体系的设计
为提高circRNA合成过程中核酶的利用效率，研究人员设计了由核酶RNA和底物RNA组成的SIE系统。与PIE体系不同，SIE将核酶核心序列集中于核酶RNA上，避免其被GOI序列分隔，从而更有利于形成催化所需的高级结构；GOI及少量核酶末端序列则位于底物RNA上。核酶RNA通过识别序列与底物RNA特异结合，形成具有催化活性的核酶-底物复合物，并经两次转酯反应生成circRNA。反应完成后，核酶仍保持完整和活性，可继续参与多轮催化，从而突破传统PIE体系中核酶不可重复利用的限制。
图1｜SIE环状RNA合成系统的设计
不同核酶拆分位点对circRNA合成的影响
为保留SIE体系中核酶的完整结构，研究人员根据T4噬菌体和Anabaena来源I型内含子的结构特征，将L1/L2环至L9.1/L9.2环之间的序列作为核酶核心。随后利用PIE体系筛选拆分位点，并以L6位点为对照。结果显示，T4核酶各拆分位点的环化效率均低于L6；Anabaena核酶仅L1和L9.1位点具有明显活性，其中L9.1接近L6。因此，L1和L9.1被确定为后续SIE体系的候选拆分位点。
图2｜不同环区切割构建的PIE体系circRNA合成能力评估
SIE体系实功能性成circRNA合成
基于前期筛选结果，研究人员选择Anabaena来源核酶构建SIE体系，并将L1和L9.1环区设为拆分与重构位点。通过延长L1端识别序列，circRNA合成效率显著提高，并据此设计出AnaR核酶及其配套底物。实验结果表明，AnaR可高效催化含CVB3 IRES和EGFP序列的线性RNA形成circRNA，且连接位点准确。所得circRNA转染细胞后可显著表达EGFP，说明SIE体系能够合成功能性circRNA。
图3｜SIE体系介导的circRNA合成
SIE体系催化条件的优化
为优化SIE体系的circRNA合成效率，研究人员系统考察了核酶与底物比例、反应时间、Mg²⁺浓度、反应温度及识别序列（RS）长度。结果显示，核酶与底物摩尔比为2:1时效率最佳，继续增加核酶用量无明显提升；反应5分钟内接近最大水平，并在3分钟后进入平台期。Mg²⁺浓度以8–10 mM为宜，过高会加剧RNA降解；在42–55℃范围内，体系均保持较高合成效率。此外，当L1和L9.1区域的RS同时延长至60 nt时，circRNA产量逐步提高，而继续延长至100 nt未见显著增益。
图4｜SIE体系中核酶/底物比例、反应时间、Mg²⁺浓度、反应温度及识别序列长度对circRNA合成的影响
SIE体系的通用性与修饰优势
为评估SIE体系的通用性，研究人员测试了不同长度RNA底物，结果显示其可高效合成长达5.7 kb的circRNA，且生产效率优于PIE、STS和TRIC。该体系在−80℃保存30天后仍保持较高活性，并具有良好重复性。在修饰核苷酸掺入超过50%时，PIE和TRIC的合成能力明显下降；即使m⁶ATP或m¹ψTP完全替代ATP或UTP，SIE体系仍保持较强的circRNA合成活性，体现出其在化学修饰circRNA制备方面的优势。
图5｜SIE体系合成化学修饰circRNA
核酶固定化用于circRNA合成
为探索SIE体系在规模化生产中的应用潜力，研究人员将3′端生物素化核酶固定于链霉亲和素磁珠，并用于催化circRNA合成。随着反应循环次数增加，产物中的circRNA逐步积累，表明固定化核酶可支持连续合成。进一步经过20轮重复反应后，固定化核酶仍保持较强的circRNA合成活性，但产量有所下降。此外，磁珠分离后，产物中的核酶污染可忽略不计，有助于简化后续核酶去除和纯化流程。结果表明，SIE体系可实现核酶固定化、回收与重复利用，为circRNA的规模化制备提供了新的技术路径。
图6｜SIE体系固定化核酶的循环利用及circRNA合成
SIE体系合成circRNA的翻译能力
为评估SIE体系合成circRNA的表达能力，研究人员制备了编码抗PD-L1抗体和人促红细胞生成素的circRNA。细胞实验显示，两种circRNA均较对应mRNA具有更持久的蛋白表达和更长的表达半衰期。进一步将circRNAhEPO经LNP包封并注射小鼠后，其显著提高了外周血网织红细胞比例，且效果优于mRNA组；各组间ALT、AST、肌酐和TNF-α水平均无显著差异。结果表明，SIE合成的circRNA具有持续表达能力和蛋白替代治疗潜力。
图7｜SIE体系合成circRNA的翻译能力
总结
本研究开发了用于circRNA合成的SIE体系，通过分离核酶与RNA底物，突破了传统PIE体系在结构设计和核酶重复利用方面的限制，可高效制备长片段及化学修饰circRNA。该体系还能通过核酶固定化实现回收利用并简化纯化流程，所合成的circRNA具有持久的蛋白表达能力和良好的体内应用潜力，为circRNA规模化生产及蛋白替代治疗提供了新的技术平台。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-026-75923-8