环状RNA（circular RNA，circRNA）因其共价闭合结构而具有较高的稳定性，在RNA疫苗和RNA治疗等领域受到广泛关注。随着蛋白编码型circRNA研究不断推进，其体外制备对环化效率提出了更高要求。尤其对于长链circRNA，如何在不引入额外序列的前提下提高环化效率，是其体外制备中需要解决的重要问题。
近日，韩国Rznomics Inc.研发中心Kyung Hyun Lee和Seong-Wook Lee团队在 Nucleic Acids Research 发表题为 “Target site selection and P1 engineering enable highly efficient circular RNA production via end-to-end self-targeting and splicing” 的研究论文。
该研究针对端到端自靶向剪接（self-targeting and splicing，STS）体系在长GOI中自环化效率下降的问题，从靶位点选择和P1构建体工程化两个方面进行了系统优化。优化后的STS体系提高了长GOI的环化效率，对于约8 kb的GOI，其自环化效率最高可达到传统PIE方法的约2倍，且最终circRNA中不引入额外序列，为长链circRNA的体外制备提供了可参考的优化策略。
靶位点位置影响自环化效率
为评估靶位点位置对STS自环化效率的影响，研究团队选用此前筛选中表现较好的AU16序列（5′-AUUUAU-3′），并将其分别置于CDS 3′端、IRES内部和CDS内部，比较不同靶位点位置下P1构建体的自环化效率。
经4%变性PAGE分析，AU16位于CDS内部时，相对circRNA条带强度最高，为18%；位于IRES内部时最低，为6.2%。这表明，即使采用相同的靶序列，其在GOI中的位置不同，自环化效率也会有所差异。随后，研究团队通过circRNA特异性RT-PCR及连接位点测序，确认各构建体均形成了预期的剪接连接位点。
图1. CVB3-sGFP-AC30 GOI中P1构建体的自环化效率
Spacer长度影响自环化效率
在前述结果基础上，研究团队进一步考察了直接来源于GOI内部的不同靶位点是否同样存在位置相关的自环化差异，并将AC30 spacer替换为AC70，以评估spacer变化对自环化效率的影响。除CDS 3′端的AU16为外源引入外，其余靶位点均直接选自GOI自身序列。
结果显示，在相同AU16靶位点下，AC30和AC70构建的自环化效率分别为9.2%和0.8%。在AC70背景下，P1/P10/AS构建的自环化效率约为6.8%，高于普通P1构建的约1%。这些结果表明，spacer长度以及靶位点的选择均会影响STS介导的自环化效率。
图2. 对GOI不同区域含有不同靶序列的CVB3-sGFP-AC70构建体进行分析
CVB3 IRES中的AU11适用于不同GOI和spacer长度
前述结果表明，靶位点选择会影响STS自环化效率。基于此，研究团队进一步比较了CVB3 IRES中的不同AU-rich靶位点。结果显示，AU11（5′-UUUAUU-3′）的自环化表现优于AU19（5′-UAUUAU-3′）：变性PAGE分析中，两者的相对circRNA条带强度分别为16%和5.8%；HPLC分析中，circRNA比例分别为57%和13%。
随后，研究团队将AU11应用于多种含CVB3 IRES的GOI，包括FLuc、RLuc、d2EGFP、GLuc和EPO等，GOI长度最高约3.5 kb，均可获得相应circRNA。进一步分析发现，在采用AU11靶位点时，spacer由AC20增加至AC108并未明显影响CVB3-RLuc的自环化效率，不同spacer长度所得circRNA的RLuc表达水平也基本一致。
此外，在无spacer的CVB3-FLuc构建中，STS的自环化效率为14%，高于PIE方法的9.9%。这些结果表明，AU11可在不同GOI及较宽的spacer长度范围内支持STS介导的自环化。
图3. 采用CVB3 IRES内AU11或AU19靶位点的P1构建体自环化效率
P1结构工程提高STS自环化效率
长GOI的靶位点筛选较为耗时，因此研究团队进一步对P1构建体中IGS上游区域进行优化。采用相同AU11靶位点时，CVB3-Omicron spike（4569 nt）和CVB3-dCas9（4851 nt）的自环化效率分别为14%和37%（E-gel），表明GOI长度并非影响STS效率的唯一因素，序列背景和RNA整体构象也可能参与其中。
在IGS上游加入polyA10后，CVB3-Omicron spike的自环化效率提高至23%（E-gel），CVB3-dCas9则为25%；部分次优靶位点的环化效率也得到提高。对于约7.8 kb的CVB3-Factor VIII，polyA10-IGS使自环化效率由8%提高至33%。
进一步比较不同polyN序列发现，polyA整体表现较好，部分具有较强局部配对或自互补能力的序列效率较低，提示IGS上游序列组成会影响STS自环化效率。
图4. 通过polyA10-IGS P1构建体工程化策略提高STS反应的自环化效率
反义序列提高P1构建体的自环化效率
在polyA10-IGS P1基础上，研究团队进一步在polyA10的5′端引入反义序列（AS），使其与靶位点或上游区域形成互补配对。其中，AS14-polyA10-IGS在CVB3-Omicron spike构建中自环化效率最高。
采用该设计后，CVB3-Omicron spike的自环化效率达到49%（E-gel）和44%（HPLC），高于polyA10-IGS和PIE方法。对于约7.8 kb且不含spacer的CVB3-Factor VIII，AS-polyA10-IGS的环化效率达到49%，而PIE方法为23%，约为其2倍。
此外，该P1优化未明显影响circRNA的蛋白表达。RNase R处理后，CVB3-Omicron spike circRNA比例提高至约75%，经IP-RP HPLC纯化后纯度超过95%。这些结果表明，加入AS可进一步提高STS介导的自环化效率，并适用于长链GOI的circRNA制备。
图5. 通过AS-polyA10-IGS P1构建体进一步提高自环化效率
总结
本研究围绕STS介导的circRNA自环化效率展开，发现其受到靶位点位置、spacer以及P1构建体设计等因素的影响。通过对这些因素进行优化，可以改善不同目的基因，尤其是长链目的基因的circRNA制备效率。
靶位点的选择不仅需要考虑序列本身，还需要结合其所在的RNA结构环境进行评估。P1结构工程可进一步提高STS自环化效率，同时减少额外spacer等序列的引入，为长链circRNA的体外制备提供了可参考的技术策略。
原文链接：
https://academic.oup.com/nar/article/54/16/gkag869/8785321?login=false