mRNA技术在疫苗开发和蛋白替代治疗等领域展现出广阔的应用前景，但其在细胞内稳定性有限，容易发生降解，影响蛋白的持续表达。环状RNA（circRNA）由于具有共价闭合结构，能够有效抵抗核酸酶降解，在提升RNA稳定性方面具有天然优势。然而，天然circRNA缺乏5′ Cap结构，主要依赖Cap非依赖性方式启动翻译，蛋白表达效率通常低于传统线性mRNA。如何兼顾circRNA的稳定性和Cap依赖型翻译效率，成为RNA工程领域的重要研究方向。
近日，德国慕尼黑大学Andrea Rentmeister团队在 Angewandte Chemie International Edition 发表题为 “Circular Photocaged mRNA for Light-induced Late-stage Activation of Translation” 的研究论文。
该研究构建了一种光控环状mRNA体系——Cyclic Click Cap-containing mRNA（CyCliCap-mRNA）。该体系结合了环状RNA的稳定性和Cap依赖型翻译特性，使mRNA能够在保持稳定的同时实现光控激活，为时序可控的mRNA表达提供了新的研究思路。
图1. CyCliCap-mRNA的设计原理
CyCliCap的设计与合成
为构建可光控激活的环状mRNA，研究人员设计并合成了一种5′ Cap0类似物——CyCliCap。该分子在mG的N位引入带有炔基的NPM光保护基，既可用于后续点击环化，又能阻碍eIF4E与Cap结合，使mRNA在光照前保持翻译沉默。研究人员通过多步有机合成获得CyCliCap，并利用NMR和HRMS完成结构表征。光照实验表明，其光保护基可在365 nm下30秒或405 nm下90秒内完成脱保护，而420 nm无法完全脱保护，为后续构建光控环状mRNA奠定了基础。
图2. CyCliCap（1）的合成示意图
mRNA两端的功能化标记
研究人员利用T7 RNA聚合酶将CyCliCap共转录引入mRNA 5′端，并通过HPLC实现带帽mRNA的纯化。随后，在3′端poly(A)尾引入叠氮基，并分别对5′端和3′端进行荧光标记。结果显示，两端均可成功修饰；光照后，5′端Cy5信号明显减弱，而3′端SRB信号基本不变，说明光保护基可被选择性去除，同时保留3′端修饰。由此，mRNA两端分别获得了可用于后续点击环化的炔基和叠氮基。
图3. CyCliCap的性能表征及mRNA 5′端CyCliCap和3′端2′-叠氮脱氧腺苷的双端标记
CyCliCap-mRNA的构建与验证
研究人员利用DNA splint辅助的CuAAC点击化学反应，将mRNA 5′端的CyCliCap与3′端修饰的poly(A)尾连接，构建获得环状CyCliCap-mRNA。通过CyCliCap合成、mRNA制备、纯化、3′端修饰、点击环化和凝胶纯化等步骤，最终获得目标环状产物。
凝胶分析和末端标记实验进一步证实CyCliCap-mRNA形成了环状结构。其中，HiBiT-mRNA和GLuc-mRNA的环化效率分别约为35%和14%。此外，365 nm光照可诱导环状CyCliCap-mRNA发生线性化，证明该体系具有光响应特性，为后续光控翻译激活提供基础。
图4. 基于支架引导点击化学实现mRNA环化
CyCliCap-mRNA的细胞内光控翻译
研究人员将CyCliCap-mRNA转染至HeLa细胞。结果显示，CyCliCap-mRNA在未光照条件下保持较低翻译水平；经365 nm光照后，蛋白表达显著增加，说明其可在细胞内实现光控翻译激活。进一步研究发现，CyCliCap-mRNA在转染后32小时、48小时甚至56小时仍可被光激活，而未环化的线性mRNA则无法实现晚期翻译启动，表明环化有助于延长mRNA在细胞内的可激活时间。eGFP实验也显示，黑暗条件下几乎无绿色荧光，光照后则恢复明显表达。总体来看，CyCliCap-mRNA能够在细胞内保持翻译沉默，并在较晚时间点通过光照重新启动蛋白表达。
图5. CyCliCap-mRNA在HeLa细胞中的翻译关闭与光诱导晚期激活
总结
本研究构建了光控环状mRNA平台——CyCliCap-mRNA，并验证了其在细胞内实现晚期翻译激活的能力。研究表明，CyCliCap-mRNA可在无光条件下保持翻译沉默，并在光照刺激后恢复蛋白表达，同时在转染后较长时间内仍具备激活能力。该研究结合了环状RNA的稳定性与Cap依赖型翻译优势，为实现mRNA表达的时间调控提供了新的策略。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.8731921