Cancer Letters｜持续表达、免疫记忆与微环境重塑：circRNA肺癌疫苗新证据

mRNA疫苗已在传染病防控中取得进展，并逐步应用于肿瘤免疫治疗。然而，mRNA易受核酸酶降解，抗原表达持续时间有限，稳定性与免疫原性之间也需要进一步协调。非小细胞肺癌患者，尤其是晚期患者，预后仍然较差，因此需要探索新的治疗策略。环状RNA（circRNA）具有共价闭合结构，对核酸酶降解具有较强耐受性，并可延长蛋白表达时间，为肿瘤疫苗的开发提供了新的选择。

近日，北京大学人民医院邱满堂、王俊、陈克终团队在Cancer Letters发表题为“Circular RNA-based therapeutic vaccine elicits potent antigen-specific antitumor immunity and remodels tumor microenvironment in lung cancer”的研究论文。

该研究基于NeoAna平台构建了靶向NY-ESO-1的circRNA治疗性疫苗，并采用脂质纳米颗粒进行递送，系统分析了其免疫原性、抗肿瘤活性及对肿瘤免疫微环境的影响，同时评估了其与PD-1阻断联合应用的效果，为circRNA肿瘤疫苗的开发及联合免疫治疗研究提供了实验依据。

circRNA疫苗抗肿瘤作用及其机制示意图

circRNA的合成与功能表征

研究团队基于NeoAna平台构建了仅含IRES和抗原编码序列的circRNA，并通过RNase R处理、反向剪接位点PCR及Sanger测序验证其成功环化。与对应mRNA相比，circRNA表现出更高的稳定性和更持久的蛋白表达能力；经RNase R富集和HPLC纯化后，其表达水平进一步提高。该结果在293T、A549和H1299细胞中均得到验证，且未检测到明显细胞毒性，表明NeoAna平台制备的circRNA具有较好的稳定性、翻译能力和细胞相容性。

图1. NeoAna环状RNA的合成与表征

circRNA疫苗激活抗原特异性免疫

为评估circRNA疫苗的体外免疫活性，研究团队首先比较了circRNA_NY-ESO-1与对应mRNA的先天免疫效应。结果显示，circRNA诱导的先天免疫反应更强，而m1Ψ修饰和HPLC纯化分别降低了mRNA和circRNA的免疫原性。随后，采用SM102脂质纳米颗粒包封circRNA，所得制剂包封率较高且未见明显细胞毒性。体外共培养进一步表明，circRNA疫苗可促进树突状细胞成熟及T细胞增殖与活化，表明其能够促进抗原交叉呈递和T细胞应答。

图2. circRNA疫苗介导的体外先天免疫反应和T细胞免疫应答

circRNA疫苗激活CD8⁺ T细胞免疫

为评估circRNA疫苗的体内免疫原性，研究团队对C57BL/6小鼠进行肌内免疫。结果显示，疫苗可提高CD8⁺ T细胞数量及CD8⁺/CD4⁺比例，增加IFN-γ⁺和TNF-α⁺ T细胞，诱导NY-ESO-1特异性T细胞和IgG抗体应答，并增强淋巴细胞对NY-ESO-1阳性肿瘤细胞的体外杀伤能力。上述结果表明，circRNA疫苗可诱导以细胞毒性CD8⁺ T细胞和Th1反应为主的抗原特异性免疫。

图3. circRNA疫苗在体内诱导CD8⁺ T细胞和Th1型免疫应答

circRNA疫苗增强抗肿瘤免疫

研究团队在NY-ESO-1过表达的皮下及原位肺癌模型中评估RNA疫苗的抗肿瘤作用。结果显示，mRNA和circRNA疫苗均可抑制肿瘤生长、增强抗原特异性T细胞反应并促进T细胞浸润，其中circRNA疫苗抑瘤效果更强，抑瘤率为62.7%，高于mRNA疫苗的41.4%。两种疫苗在原位模型中均可延缓肿瘤进展并改善生存，且未见明显全身毒性。上述结果表明，circRNA疫苗具有较好的抗肿瘤活性和体内安全性。

图4. circRNA疫苗在肺癌皮下模型中诱导抗原特异性免疫反应并抑制肿瘤生长

circRNA疫苗诱导持久免疫记忆

研究团队通过预防性接种和术后肿瘤再接种模型评估circRNA疫苗的免疫记忆作用。结果显示，预防性接种可抑制肿瘤生长并延长小鼠生存，记忆T细胞和成熟DC在肿瘤组织中增加。在术后模型中，circRNA疫苗降低了肿瘤复发，5只小鼠中有4只保持无瘤状态。结果表明，circRNA疫苗可诱导较持久的免疫记忆，并对肿瘤形成和复发产生保护作用。

图5. 预防性及术后免疫通过诱导免疫记忆，抑制肿瘤形成和复发

circRNA疫苗依赖CD8⁺ T细胞并协同PD-1阻断

为明确circRNA疫苗抗肿瘤作用所依赖的T细胞亚群，研究人员进行了CD4⁺和CD8⁺ T细胞耗竭实验。去除CD8⁺ T细胞后，疫苗的抑瘤作用基本消失，而去除CD4⁺ T细胞未明显影响肿瘤控制，说明其抗肿瘤作用主要依赖CD8⁺ T细胞。进一步研究发现，circRNA疫苗与抗PD-1抗体联合治疗的抑瘤率达到93.1%，5只小鼠中有1只肿瘤完全消退，且未见明显毒性。结果表明，PD-1阻断可进一步提高circRNA疫苗的抗肿瘤效果。

图6. CD8⁺ T细胞介导抗肿瘤免疫，circRNA疫苗与抗PD-1联合治疗协同增强疗效

circRNA疫苗重塑肿瘤免疫微环境

为分析circRNA疫苗对肿瘤免疫微环境的影响，研究人员对肿瘤组织进行了单核RNA测序。结果显示，治疗后T细胞、cDC和巨噬细胞浸润增加，成纤维细胞比例下降；联合PD-1阻断进一步增加T细胞浸润，并增强cDC与T细胞、T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用。

亚群分析发现，治疗增加了具有细胞毒性特征的CD8 Tpex细胞，以及M1型和抗原呈递型巨噬细胞，同时减少M2型和SPP1巨噬细胞。circRNA疫苗还促进了抗原呈递型癌相关成纤维细胞扩增。上述结果表明，circRNA疫苗单独使用或联合PD-1阻断，可通过调节T细胞、巨噬细胞和成纤维细胞，推动肿瘤免疫微环境向促炎和抗肿瘤状态转变。