个体化mRNA新抗原疫苗在肿瘤免疫治疗中具有重要应用价值，但其生产依赖质粒构建与体外转录（IVT）等复杂环节，制备周期常超3个月，易致病情快速进展的患者错过治疗窗口。相比之下，固相化学合成RNA（如反义寡核苷酸）无需DNA模板与IVT，制备周期显著缩短。然而，受合成长度限制，传统RNA寡核苷酸难以容纳完整的蛋白编码与翻译调控元件。因此，如何在有限长度内实现有效翻译，成为化学合成RNA应用于个体化肿瘤疫苗亟待突破的关键问题。
近日，复旦大学璩良研究员团队在PNAS发表题为“IVT-free, chemically synthesized protein-encoding RNA oligonucleotides for rapid production of personalized cancer vaccines”的研究论文。
该研究开发了一类无需体外转录的蛋白编码RNA寡核苷酸（PEO）。研究团队在序列中引入了39 nt的帽非依赖性翻译增强元件BBV，并在化学合成RNA的两端分别修饰5′-OH和3′-P。该RNA进入细胞后，可被内源性RtcB连接酶环化，继而通过滚环翻译持续产生抗原蛋白。最后，研究进一步在黑色素瘤和原位胶质瘤模型中，验证了该PEO疫苗的免疫学特征及抗肿瘤疗效。
BBV元件介导翻译起始
RNA固相化学合成通常受限于150～200 nt，难以容纳5′帽、poly(A)尾及传统长IRES元件。研究团队对28种CITE元件进行筛选，发现来源于Black Beetle Virus的BBV仅含39 nt，其终止密码子可通过调整阅读框规避，适用于滚环翻译。
细胞实验表明，BBV可驱动线性RNA和环状RNA翻译；删除、反向插入、截短或突变BBV均会显著降低蛋白表达。计算对接进一步提示，BBV可能通过与翻译起始因子eIF4G相互作用促进翻译。因此，BBV可作为化学合成RNA寡核苷酸的候选翻译起始元件。
图1. 短CITE元件介导RNA翻译起始
5′-OH/3′-P末端介导RNA环化
鉴于BBV介导的翻译起始效率有限，研究团队进一步引入滚环翻译策略。利用RtcB可连接RNA 5′-OH与3′-P末端的特性，研究者设计了具有5′-OH/3′-P末端的RNA寡核苷酸。RNase R消化、细胞转染及Sanger测序结果证实，该RNA可在哺乳动物细胞内准确环化，形成稳定的环状RNA，为滚环翻译提供模板。
PEO实现滚环翻译
为验证环化RNA能否进行滚环翻译，研究团队将RNA寡核苷酸转染HEK293T细胞。仅具有5′-OH/3′-P末端且不含终止密码子的RNA能够产生高分子量Flag蛋白，质谱检测到跨越BBV与Flag连接位点的特异性肽段HATMDYK，P2A实验进一步证实了滚环翻译的发生。该翻译模式随后在A549细胞、HeLa细胞及人原代T细胞中得到验证。基于此，研究团队将这种含BBV元件和5′-OH/3′-P末端的化学合成RNA命名为蛋白编码RNA寡核苷酸（PEO）。
图2. 具有5′-OH和3′-P末端的化学合成RNA寡核苷酸可在哺乳动物细胞中形成环状RNA并实现滚环翻译
PEO具有低免疫原性和细胞毒性
为评估PEO的免疫学特征，研究团队将其与未修饰mRNA、m1Ψ修饰mRNA及icRNA进行比较。结果显示，PEO未检测到双链RNA杂质，仅诱导极低水平的PKR活化，并表现出较低的细胞毒性。RT-qPCR和转录组测序进一步证实，PEO诱导的炎症因子、趋化因子及RIG-I表达均明显低于体外转录RNA，免疫相关基因表达谱也更接近未处理细胞。综上，PEO具有较低的免疫原性和细胞毒性，为其进一步应用于RNA治疗提供了良好的安全性基础。
图3. PEO表现出极低的免疫原性和较低的细胞毒性
PEO疫苗抑制肿瘤生长
为评估PEO平台的肿瘤治疗潜力，研究团队构建了PEO-OVA疫苗。体内外实验表明，PEO-OVA能够高效诱导抗原呈递和SIINFEKL特异性CD8⁺ T细胞应答，增强肿瘤组织CD8⁺ T细胞浸润并显著抑制肿瘤生长。其抗肿瘤效果和生存获益与m1Ψ修饰mRNA、PIE来源circRNA及Tornado来源icRNA总体相当，同时具有无需体外转录的制备优势。
图4. 基于PEO的肿瘤疫苗显著抑制肿瘤生长
PEO疫苗协同PD-1抑制胶质瘤生长
为评估PEO在胶质瘤中的应用潜力，研究者构建了IDH1-R132H突变原位胶质瘤模型。PEO单药可轻度抑制肿瘤生长，与抗PD-1联合后疗效进一步增强，提示其可重塑肿瘤免疫微环境并提高免疫治疗响应。相比体外转录circRNA，PEO在疾病晚期仍表现出更好的抗肿瘤效果。此外，通过体外拼接和RtcB环化，研究者成功构建了252 nt的延长型PEO，实现了更长治疗性多肽的编码与翻译。
图5. PEO-IDH1-R132H疫苗降低了小鼠高级别胶质瘤（HGG）模型的肿瘤负荷
总结
本研究构建了一种无需体外转录的蛋白编码RNA寡核苷酸（PEO）平台。该平台通过细胞内RNA环化和滚环翻译实现蛋白表达，避免了体外转录产生的双链RNA副产物，具有较低的免疫原性和细胞毒性，并在肿瘤疫苗和联合免疫治疗中展现出良好的应用潜力。
PEO为RNA药物开发提供了一条不同于传统mRNA的新技术路线，也为个体化肿瘤疫苗及蛋白替代治疗提供了新的平台选择。不过，其仍受化学合成长度、编码容量和翻译产物均一性等因素限制，未来仍需进一步优化递送体系，并验证长期安全性和临床转化的可行性。
原文链接：
https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2529799123