circRNA具有较高的稳定性，其异常表达与多种肿瘤的发生、侵袭和进展密切相关，被认为是具有潜力的肿瘤诊断和分子分型标志物。然而，现有检测方法多依赖RNA提取、逆转录和核酸扩增，难以直接监测活细胞内circRNA的动态变化，且大多集中于单一靶标分析。此外，circRNA与其线性同源转录本具有较高的序列相似性，如何在复杂生物环境中实现多种circRNA的特异性识别与同步成像，仍是该领域面临的重要问题。
近日，东南大学张春阳、王丽娟团队在Angewandte Chemie International Edition发表题为“Construction of a Glutathione-Gated Intelligent Nanoclassifier for Spatioselective Visualization of Dual CircRNAs and Synergistic Photodynamic Therapy”的研究论文。
该研究构建了一种谷胱甘肽门控智能纳米分类器DB-CHA@PAN，实现了circCDYL和circHIPK3的同步成像及动态监测，并将其用于乳腺癌和肺癌组织分类与光动力治疗，为circRNA多靶标检测和诊疗一体化提供了新的研究思路。
GSH门控双circRNA成像与光动力治疗机制
研究团队构建了GSH门控智能纳米分类器DB-CHA@PAN，用于circCDYL和circHIPK3的同步成像及光动力治疗。该系统经AS1411介导进入肿瘤细胞后，由高水平GSH切断二硫键并启动两条CHA循环，恢复荧光和光敏剂活性，同时通过靶标循环实现信号放大。在660 nm光照下，激活的光敏剂产生单线态氧，诱导肿瘤细胞氧化损伤和凋亡。
图1｜GSH门控智能纳米分类器用于双circRNA空间选择性可视化及协同光动力治疗的工作流程示意图
DB-CHA@PA的体外构建与性能
非变性PAGE、原子力显微镜和动态光散射结果表明，PAN及DB-CHA@PAN均成功组装。经GSH解锁后，circCDYL和circHIPK3分别触发CHA-C和CHA-H反应，恢复Cy5和Cy3信号；单分子成像进一步验证了该体系的双靶标检测能力。
对照实验显示，二硫键是体系响应GSH的关键开关，两条CHA通路分别由对应circRNA特异性激活。DB-CHA@PAN具有较高的检测灵敏度和选择性，并可在660 nm光照下产生单线态氧。
图2｜DB-CHA@PAN的构建、GSH门控双circRNA检测及光敏性能验证
DB-CHA@PAN的热力学与动力学
热力学分析表明，未解锁的H1和H3可维持稳定的自互补结构，从而抑制非特异性反应；经GSH解锁后，circCDYL和circHIPK3触发CHA-C和CHA-H反应的总ΔG分别为−18.82和−15.59 kcal·mol⁻¹，说明两条反应均可自发进行。
在1 fM至100 nM范围内，两条CHA通路均保持较高的理论转化效率，表明低丰度靶标也能有效启动反应。动力学与单分子检测进一步显示，DB-CHA@PAN的反应速率和双通道荧光信号均明显高于无靶标循环对照，说明靶标循环释放可加速CHA级联反应并增强信号输出。
图3｜DB-CHA@PAN的热力学分析及靶标循环放大动力学验证
DB-CHA@PAN的细胞内双circRNA成像
研究采用共聚焦显微成像和流式细胞术评价DB-CHA@PAN在MCF-7细胞中的双circRNA成像性能。实验结果显示，DB-CHA@PAN可在MCF-7细胞中产生明显的Cy5和Cy3信号。缺失二硫键或突变相应circRNA识别序列后，对应信号显著降低，表明GSH解锁及靶标特异性识别是体系激活的关键。与无靶标循环对照相比，DB-CHA@PAN产生更强的双通道信号，说明靶标循环可增强细胞内成像。
图4｜DB-CHA@PAN在MCF-7细胞中的GSH门控双circRNA成像及靶标循环放大验证
DB-CHA@PAN对活细胞双circRNA动态的监测
研究团队首先评价了DB-CHA@PAN的细胞摄取与递送性能。缺失AS1411或封闭细胞表面核仁素后，MCF-7细胞中的Cy5和Cy3信号明显降低，表明该体系主要通过AS1411–核仁素介导的内吞进入细胞。其细胞内荧光信号在约2 h达到平台，递送效果优于游离探针和Lipofectamine 3000。
进一步的活细胞成像结果显示，DB-CHA@PAN能够区分不同细胞中circCDYL和circHIPK3的表达差异。分别或同时敲低两种circRNA后，对应荧光信号选择性降低，说明该体系可用于监测活细胞内双circRNA的表达及动态变化。
图5｜AS1411介导的DB-CHA@PAN细胞摄取及活细胞双circRNA表达与动态监测
DB-CHA@PAN的临床样本检测与诊断
研究团队进一步评价了DB-CHA@PAN的定量检测性能及临床样本分析能力。加标回收实验表明，该体系在PBS和血清中均具有较好的检测准确性和稳定性；其对不同细胞中circCDYL和circHIPK3的检测结果与qRT-PCR高度一致，并可实现单细胞水平分析。
随后，DB-CHA@PAN被用于乳腺癌和肺癌组织检测。结果显示，两种circRNA在肿瘤组织中的表达均高于邻近正常组织，且晚期样本中的表达进一步升高。双标志物联合检测对肿瘤分期的区分能力优于单一标志物；在对34份未知组织样本的盲样分析中，联合检测的敏感度、特异度和准确率均达到100%，显示出进一步开展临床验证的潜力。
图6｜DB-CHA@PAN用于双circRNA临床检测及乳腺癌和肺癌诊断评估
DB-CHA@PAN的肿瘤选择性光动力治疗
研究团队采用DCFH-DA探针评估DB-CHA@PAN的ROS生成及光动力治疗效果。在660 nm光照下，该体系可在MCF-7细胞中产生明显ROS信号和浓度依赖性光毒性，且作用强于无靶标循环对照；对正常MCF-10A细胞影响较小，无光照时则未见明显毒性。CCK-8、流式细胞术和活死细胞染色结果进一步表明，靶标循环可增强ROS生成、细胞凋亡和光动力杀伤，提高对肿瘤细胞的选择性。
图7｜DB-CHA@PAN介导的ROS生成及肿瘤选择性光动力治疗验证
DB-CHA@PAN的体内成像与抗肿瘤作用
研究团队在MCF-7荷瘤裸鼠中评价了DB-CHA@PAN的体内成像和治疗效果。DB-CHA@PAN组肿瘤区域的Cy5和Cy3信号随时间增强，注射3 h后分别为无靶标循环对照组的2.33倍和2.76倍，表明靶标循环可增强体内双circRNA成像信号。
在21天治疗实验中，DB-CHA@PAN联合660 nm光照显著抑制肿瘤生长，且效果优于无靶标循环对照。组织学结果显示，该处理可引起更明显的肿瘤损伤和细胞凋亡；同时，小鼠体重、血液生化及主要器官组织学均未见明显异常，表明该体系具有较低暗毒性和较好的初步生物安全性。
图8｜DB-CHA@PAN在MCF-7荷瘤裸鼠中的双circRNA成像、光动力治疗及生物安全性评价
总结
本研究构建了GSH门控智能纳米分类器DB-CHA@PAN，将肿瘤细胞靶向递送、双circRNA识别、荧光成像与光动力治疗整合于同一DNA纳米框架。该体系在肿瘤细胞内经GSH解锁后，可由circCDYL和circHIPK3分别触发CHA循环，实现双靶标成像及其表达动态监测。
DB-CHA@PAN还可用于不同细胞和临床组织中的circRNA表达分析，并在光照下激活光敏剂，实现肿瘤选择性光动力治疗。该研究为circRNA多靶标检测与成像引导治疗的一体化设计提供了新思路，也为DNA纳米技术在肿瘤精准诊疗中的应用提供了参考。
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.6302768