近年来，RNA疗法正从传染病疫苗拓展至肿瘤免疫、罕见遗传病等领域，对RNA稳定性、表达持久性和生产工艺提出了更高要求。环状RNA（circRNA）因共价闭合结构具备更强稳定性和长效表达潜力，但其体外制备仍受长ORF、复杂IRES以及传统PIE系统高温反应条件限制。如何在温和条件下高效合成长链、复杂结构 circRNA，成为推动该平台转化的重要问题。
近日，耶鲁大学Anna Marie Pyle教授团队在bioRxiv发表研究：“PCanPIE: A group I intron platform for efficient circRNA synthesis at ambient temperatures”。
该研究首次将白色念珠菌线粒体大亚基I型内含子应用于排列内含子-外显子系统，并开发出 PCanPIE平台，用于circRNA的体外合成。与传统 PIE 系统常需约55°C加热不同，PCanPIE可在 25°C、6 mM MgCl₂的室温条件下实现高效环化，其中P6b重排构建体的前体转化率可达约95%。这一平台为长链、结构复杂circRNA的温和制备提供了新的技术路径。
图1. I型内含子与排列内含子-外显子（PIE）剪接示意图
结构导向的PCanPIE重排设计
为构建高效circRNA合成平台，研究团队基于 C.a.mtLSU GpIA1的冷冻电镜结构（PDB: 9MQS），选择远离催化核心、较少参与长程三级相互作用的P5、P6b和P8三个外围茎环作为重排位点。研究人员将内含子的5′ 端和3′ 端分别重新定位至这些区域两侧，并通过序列微调维持局部碱基配对，构建出PCanPIE系统。
体外剪接结果显示，三个位点重排均能支持自剪接与 circRNA生成，产物可抵抗RNase R消化，说明这些外围茎环可作为功能性重排位点，为后续筛选最优构建体和评估低温剪接活性奠定了基础。
图2. C.a.mtLSU GpIA1的结构导向重排设计与circRNA合成
重排位点影响折叠而非剪接
为评估不同重排位点对剪接效率的影响，研究团队在室温条件下（25°C，6 mM MgCl₂）比较了P5、P6b和P8三种构建体。结果显示，三者生成circRNA的表观速率常数相近，说明重排位点并未显著改变内含子的催化速率。
但三种构建体的最终环化效率差异明显。其中，P6b 表现最佳，反应结束时前体残留仅为5.3 ± 0.1%，环化效率达94.7%，显著高于P5和P8。该结果表明，重排位点主要影响RNA正确折叠为活性构象的比例，而非催化反应本身的速度。因此，研究团队选择P6b 作为后续大片段circRNA制备的核心设计。
图3. P5、P6b和P8 PCanPIE构建体的动力学分析显示其在低温与低镁离子浓度下可实现高效剪接
间隔序列优化恢复高效剪接
在确定P6b为最优重排位点后，研究团队进一步测试了其对更大circRNA的合成能力。结果发现，直接增加200 nt载荷会干扰内含子的正确折叠，导致异常剪接或前体残留增加。为减少结构干扰，研究团队保留必需的P1/P10配对区，并将mtLSU来源的间隔序列替换为中性序列。
结果显示，20 nt间隔序列效果最佳，circRNA产量最高、前体残留最少，且兼容P5、P6b和P8等不同重排位点。这一结果表明，优化间隔序列可有效恢复 PCanPIE的高效剪接能力，为大片段circRNA制备提供支持。
图4. PIE间隔序列优化以实现高效环化
长链与复杂结构circRNA的制备验证
为评估PCanPIE对大片段circRNA的适用性，研究团队测试了四种长度和复杂度递增的载荷：250 nt的 circActin、420 nt且含内部重复和二级结构的 circATV、934 nt的天然circZnf609，以及1,657 nt、同时包含ORF和结构化IRES的circCVB3 EGFP。
结果显示，四种构建体均能在体外转录过程中生成目标circRNA，并经RT-PCR和纳米孔测序确认。该结果表明，重新设计的连接区和间隔序列可支持不同长度和结构背景下的高效环化，为长链、结构化及天然来源 circRNA 的温和体外制备提供了通用平台。
图5. PCanPIE P6b高效生成大片段及序列多样的circRNA
总结
本研究通过结构导向重排设计与间隔序列优化，建立了可在温和条件下高效运行的PCanPIE平台。该平台降低了传统PIE系统对高温反应的依赖，有助于减少长链RNA在高温制备过程中的降解风险，并提升了体系对长ORF、结构化IRES及天然circRNA序列的兼容性。该研究为I型内含子PIE工具箱提供了新的平台选择，也为大片段、复杂结构circRNA的体外合成及后续制备工艺优化提供了参考。
原文链接：
https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.05.11.724386v1