2型糖尿病（T2DM）和肥胖症是全球范围内持续增长的代谢性疾病负担，并与心血管疾病、慢性肾病等多种并发症密切相关。近年来，以司美格鲁肽为代表的GLP-1受体激动剂（GLP-1RA）在血糖控制和体重管理中展现出明确疗效，也推动药企围绕长效化、口服化、多靶点联合激动剂及RNA治疗平台等方向持续布局。
在RNA药物方向，Novo Nordisk与Replicate Bioscience围绕自复制RNA技术开展合作，探索其在肥胖、2型糖尿病及其他心血管代谢疾病中的应用；Eli Lilly也与HAYA Therapeutics合作，基于RNA相关平台寻找肥胖及代谢性疾病的新型调控靶点。这些进展提示，RNA技术正在进入代谢性疾病药物开发视野。
相比线性mRNA，环状RNA（circRNA）凭借共价闭合结构具有更强的抗核酸酶降解能力和更持久的蛋白表达潜力，有望用于构建长效GLP-1RA表达平台。不过，circRNA的高效环化、低免疫激活、体内递送和规模化生产仍是限制其转化应用的重要问题。
近日，上海交通大学郭熙志教授团队在Journal of Advanced Research发表研究论文：Synthesis of scarless circular RNAs expressing long-acting GLP-1RAs for type 2 diabetes therapy。
该研究开发了一种基于无痕环化系统（SLPIE）的circRNA治疗平台。通过优化EV-B107_IRES、5%–7% m⁶A修饰及DOPE-LNP递送体系，提高了circRNA表达效率，并降低免疫激活水平。编码GLP-1及其衍生物GLP-1_FcBO的无痕circRNA在糖尿病小鼠中表现出持续的降糖和减重作用，并在7天观察期内达到与司美格鲁肽相当的疗效。此外，研究还探索了基于RNase III缺陷型大肠杆菌的可扩展生产体系，为circRNA药物用于糖尿病和肥胖症治疗提供了新的技术参考。
无痕SLPIE介导circRNA环化与表达
研究团队首先建立了无痕环状RNA合成策略。该策略将PIE系统所需的核心E1/E2序列嵌入CVB3_IRES元件，以减少传统PIE成环后残留的外源序列。实验结果显示，SLPIEv2的环化效率为74.03%，接近传统PIE系统的78.85%；同时，SLPIEv2生成的circEGFP可在HEK293T细胞中驱动EGFP表达，表明该系统在实现无痕环化的同时保留了IRES介导的翻译活性。
图1. 基于分裂型CVB3_IRES的无痕PIE系统合成circRNA的策略
IRES元件与表达骨架优化
为提高无痕circRNA的翻译效率，研究团队比较了CVB3、EV-B107和HRV-B3等IRES元件在SLPIE体系中的表现。结果显示，EV-B107_IRES在SLPIEv2构型中具有较好的翻译活性，介导的circFLuc在HEK293T、HepG2和Caco-2细胞中均表现出较高荧光素酶活性。测序和凝胶分析证实，该体系可实现准确环化。进一步优化调控元件后，研究发现将6×polyAC置于ORF终止密码子后可提高翻译活性，并据此确定了由split EV-B107_IRES、ORF和6×polyAC组成的circRNA表达骨架。
图2. 无痕circRNA翻译中IRES元件与调控元件的优化
m⁶A修饰优化circRNA表达与免疫原性
为进一步优化circRNA性能，研究团队评估了核苷酸修饰对SLPIEv2体系的影响。结果显示，5% m⁶A修饰可提高不同IRES介导的circFLuc翻译效率，而5% m¹Ψ修饰会影响circRNA形成并降低蛋白表达。进一步分析表明，5%–7%的m⁶A掺入比例较为适宜，10% m⁶A则不利于表达。免疫原性检测显示，与传统PIE和未修饰SLPIEv2体系相比，含5% m⁶A修饰的SLPIEv2-circRNA在A549细胞中诱导的RIG-I、IL-6、IFNβ和TNFα表达水平较低，提示该修饰方式有助于提升翻译效率并降低免疫激活。
图3. 通过SLPIEv2策略合成并掺入5% m⁶A的circRNA表现出较低免疫原性
DOPE-LNP介导circRNA体内递送与持续表达
在验证SLPIEv2体系可驱动circRNA表达后，研究团队评估了LNP介导的体内递送效果。经IVT合成和RP-HPLC纯化的circFLuc平均纯度为95.11%。配方比较显示，DOPE-LNP较DSPC-LNP具有更高的翻译效率。小鼠腹腔注射后，LNP递送的circFLuc信号可持续至144小时，而线性mRNA约持续72小时。免疫原性分析显示，相关炎症因子未见明显升高，表明DOPE-LNP可支持SLPIEv2-circRNA的体内递送和持续表达。
图4. LNP包封的SLPIEv2 circRNA可在体内实现持续稳定的蛋白表达
circGLP-1改善T2DM小鼠代谢
为构建circRNA编码的GLP-1RA，研究团队对GLP-1进行工程化改造，并基于SLPIEv2体系和5% m⁶A修饰构建了circGLP-1、circGLP-1_FcBO和circproGCG。体外实验显示，circGLP-1和circGLP-1_FcBO可激活GLP1R/cAMP信号通路。在T2DM小鼠模型中，单次注射LNP递送的circGLP-1相关RNA后，小鼠表现出持续的血糖控制和体重下降，并在7天观察期内显示出与司美格鲁肽相当的疗效。上述结果表明，基于circRNA的GLP-1RA表达策略具有一定的长效代谢干预潜力。
图5. circGLP-1 RNA在T2DM小鼠模型中的治疗效果
SLPIEv2用于circRNA细菌生产探索
为评估circRNA的规模化生产可行性，研究团队将SLPIEv2表达框架构建至pET28a载体，并转化至RNase III缺陷型HT115(DE3)大肠杆菌中表达。结果显示，37°C和100 mM Mg²⁺条件下可检测到circRNA生成，并可合成circGLP-1和circEGFP。RNase R消化实验表明，所得circGLP-1具有环状RNA特征；功能实验显示，其可激活GLP-1受体信号通路。上述结果提示，SLPIEv2体系可用于大肠杆菌中circRNA生产的进一步探索。
图6. SLPIEv2系统在大肠杆菌中合成circRNA
总结
本研究构建了基于SLPIEv2的无痕circRNA表达平台，并通过IRES元件筛选、翻译调控元件优化和m⁶A修饰，提高了circRNA的表达效率，同时降低了免疫激活水平。结合DOPE-LNP递送体系，该平台在体内验证了持续蛋白表达能力，并在T2DM小鼠模型中显示出代谢干预效果。此外，研究还利用RNase III缺陷型HT115(DE3)大肠杆菌探索了circRNA的体内合成，提示其在生产放大方面具有进一步优化空间。该研究围绕circRNA的设计、递送和生产可扩展性进行了系统验证，为治疗性circRNA平台开发提供了参考。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2090123226004248