以下文章来源于吉赛生物 ，作者蜗牛角
吉赛生物.
吉赛生物是引领circRNA科学研究与应用转化的先行者，根植于扎实稳健的RNA合成创新技术，持续赋能细分领域从科研到临床，致力于为全球药物研发合作伙伴，提供从早期研究到商业化生产全流程CRDMO解决方案。
传统的线性mRNA相比，环状RNA（circRNA）凭借独特的共价闭环结构，能够有效抵抗核酸外切酶的降解，从而展现出卓越的体内稳定性；同时，高纯度的circRNA还具备更低的先天免疫原性。然而，天然内源性circRNA在细胞内的表达丰度普遍极低且提取困难，远远无法满足规模化成药的需求。因此，建立高效、精准的人工合成与制备体系，是推动circRNA疗法走向临床应用的关键前提。
近日，中山大学附属第三医院联合中国海洋大学与广州吉赛生物团队在WIREs RNA上共同发表最新综述文章：“Therapeutic Prospects of Artificially Synthesized Circular RNA。”
本综述全面梳理了人工合成circRNA领域的关键技术与应用进展。文章重点概述了circRNA的制备与纯化方法、序列设计与优化策略、递送技术、质量控制标准及多维应用场景。在此基础上，作者汇总了相关药物与疗法在临床前及临床阶段的研究进展，并深入剖析了该领域面临的临床转化挑战及未来发展趋势，指出科研与产业界的紧密合作将是推动circRNA疗法走向临床的关键。
circRNA生物学特性与机制
circRNA是一类无5’帽和3’poly(A)尾的共价闭环单链RNA，在进化上具有高度的保守性及组织表达特异性，其表达水平异常与多种疾病相关。相较于线性RNA，这种共价闭环结构使circRNA具有较强的抗核酸酶降解能力，表现出更高的体内稳定性，且在特定条件下展现出较低的免疫原性。在多种内源性成环机制中，基于内含子的自剪接（尤其是I型和tRNA内含子）为后续体外人工合成circRNA技术的发展提供了重要的机制参考。
图1. 天然circRNA的产生机制、分类及功能
circRNA的临床应用前景
天然circRNA在临床转化中极具价值：既可作为体液无创液体活检（LB）的生物标志物，也可作为疾病干预的治疗靶点（如通过外源递送实现过表达，或借助RNAi、CRISPR等技术进行靶向抑制）。同时，人工合成circRNA在预防与治疗性疫苗、蛋白质替代疗法（PRT）、肿瘤免疫（如CAR-T、TCR-T、肿瘤疫苗）、基因编辑、表观遗传调控及生物传感器等前沿领域展现出广阔的应用前景。
图2. 天然circRNA与人工合成circRNA的治疗前景
circRNA的人工合成与纯化
体外合成
化学连接法主要用于修饰核酸及其类似物的成环，可分为两类：一是利用磷酸激活剂形成天然磷酸二酯键的天然连接；二是通过引入特定化学基团（如点击化学）实现的非天然连接，其催化效率更高。此外，还有一种基于高碘酸盐氧化与还原胺化的PORA化学法，该方法的核心优势在于成环时能完整保留RNA的碱基修饰（如m7G帽和m1Ψ）。
酶促连接法是大片段RNA成环的核心技术。常需引入辅助链或夹板链（Splint）来克服长链RNA折叠引发的空间位阻。常用的T4噬菌体连接酶包括：T4 DNA连接酶（Dnl）需借助DNA夹板，后续除杂繁琐；T4单链RNA连接酶（Rnl1）高度依赖夹板或底物自身折叠；而T4双链RNA连接酶（Rnl2）在双链缺口处催化效率极高（达Rnl1的50-1000倍），除兼容DNA夹板外，仅凭底物末端极短互补序列（如4 bp）即可成环，为“无夹板（Splint-free）”的通用型circRNA规模化制备奠定了基础。
图3. 体外合成circRNA的化学与酶促方法
PIE（内含子-外显子重排）技术是目前体外制备长链circRNA的核心工业化手段。该技术利用侧翼内含子的核酶自剪接活性实现转录后成环，无需外源蛋白。最常用的I型PIE系统（如T4 td或鱼腥藻来源）在Mg2+和GTP辅助下环化，引入“同源臂”可显著提升大片段成环率。为消除早期产物中可能引发免疫反应的外源序列残留（Scar），当前技术正向嵌合体PIE（CPIE）、反式核酶环化（TRIC，可合成超8 kb产物）及完全“无痕（Scarless）”制备方向迭代。
然而，PIE技术在短链（<100 nt）合成中产率受限。为弥补这一不足并提升序列精度，行业内开发了多种新型核酶催化策略，包括自我靶向剪接法（STS）、发夹核酶法、顺式连接核酶（RzL）法，以及近期涌现的直接利用天然内含子的CIRC策略、改良的SCAP系统和基于人源tRNA的自催化RNA（acRNA）策略，进一步丰富了体外高效制备手段。
图4. 合成circRNA的核酶方法
体内合成
体内人工合成circRNA主要基于两类机制：一是过程依赖型（涉及内含子剪接或切割后由连接酶介导）；二是发生依赖型（包括正常与异常反向剪接）。受tRNA/rRNA成熟启发的方法依赖体内内切酶切割及内源性连接酶（如RtcB）催化成环。代表性技术如Tornado系统，利用自剪接核酶结合tRNA连接酶实现高效环化。此外，亦可利用类病毒或转座子结合共表达连接酶在体内高效合成。尽管体内制备产量较高，但环化效率仍受构建体序列与结构特征的影响。
环化序列的优化设计
影响翻译效率的因素
circRNA的翻译效率受序列元件和m6A修饰共同影响。在5′ UTR中引入PABP基序、eIF4G适配体序列及完整IRES，可提高蛋白表达；适度的m6A修饰也有助于提升稳定性和翻译效率。但m6A的作用与其密度和位置密切相关。适量修饰有利于翻译，而过高密度可能招募抑制性识别蛋白，影响翻译过程；位于ORF上游的m6A通常更有利于翻译起始，而位于ORF内部则可能影响延伸或RNA稳定性。因此，如何精确控制m6A修饰的密度和位置，仍是人工circRNA优化中的一个问题。
序列优化软件与模型
circRNA序列优化的核心参数为密码子适应指数（CAI）、最小自由能（MFE）及内部核糖体进入位点，旨在提升翻译效率并规避复杂结构引发的免疫原性。目前，机器学习（如Vaxign）已被用于预测免疫刺激基序；空间结构预测则从传统热力学模型向AI深度学习模型（如UFold、AlphaFold2-RNA等）快速演进，显著提升了预测精度。未来，亟待开发专用于解析circRNA翻译起始终止模式的新型算法工具。
纯化方法
纯化是规避circRNA杂质（如缺口RNA、双链RNA）激活天然免疫反应（如TLRs、RIG-I）的核心步骤。传统沉淀与凝胶法难放大且无法分离缺口RNA。常用的RNase R酶解法易过度消化或受G-四链体阻碍，常结合Poly-A加尾与Oligo-dT亲和层析改良。工业色谱中，体积排阻（SEC-HPLC）易放大但难分离缺口RNA；反相（RP-HPLC）则能有效去除此类杂质。此外，高选择性亲和层析能高效去除线性副产物，其纯化产物的蛋白表达水平也显著优于HPLC方法。针对大片段易受剪切力破坏，超滤及切向流过滤（TFF）等温和工艺优势明显。未来，整合转录、环化与纯化的一步法连续工艺是规模化生产的重要趋势。
环状RNA递送技术
LNP
LNP因具有较好的生物相容性和递送效率，已成为核酸药物常用载体，但仍面临肝外靶向困难以及稳定性、安全性等问题。其在体内易富集于肝脏，不利于肝外递送；提高稳定性的措施往往又会影响包封率和递送效率，因此需要通过优化脂质组成和配方设计加以改进。
此外，LNP部分组分具有一定免疫原性和毒性，尤其PEG相关成分可能引发加速清除和超敏反应。目前的改进方向主要包括开发低免疫原性材料替代PEG、筛选更安全的可电离脂质，以及优化给药方式。
EV
外泌体（EV）是由细胞天然分泌的脂质双层囊泡，具有细胞毒性低、生物相容性较好、循环稳定性高以及可穿越血脑屏障等特点，因此被视为具有应用前景的内源性递送载体。但其临床应用仍受多种因素限制，主要包括产物异质性高、分离纯化及后续修饰困难、储存条件要求较高，以及安全性评价和质量控制标准尚不完善。此外，对外泌体内含物及其潜在影响的研究仍较有限。
VLP
VLP是由病毒结构蛋白自组装形成的纳米载体，不含病毒基因组，因此在保留病毒样颗粒免疫刺激性和组织靶向性的同时，降低了致病性风险。与LNP相比，VLP可提高RNA递送至细胞质后的利用效率，因此在mRNA等核酸递送中具有应用价值。
VLP目前主要用于mRNA递送，若用于circRNA仍需解决细胞质原位表达等问题。此外，VLP的纯化流程较复杂、成本较高，且其结构稳定性易受环境影响；由于其通过宿主细胞出芽形成，还可能携带内源性蛋白和RNA，从而影响产品一致性和递送效果。
质量控制与标准化
circRNA药物的产业化生产主要包括质粒模板制备与线性化、体外转录及环化、产物纯化和递送封装四个环节。其整体流程可参考mRNA药物，但关键差异在于环化步骤及相关杂质的去除，因此环化效率、开环风险和线性杂质控制是质量控制中的重点。
现有mRNA药物和LNP制剂的相关指南可为circRNA药物质控提供参考，但针对circRNA自身特性的标准仍需进一步建立。例如，完整circRNA与Nicked RNA在常规CE和HPLC中较难有效区分，可能影响纯度评估；双链RNA残留检测、RNase R耐受性评价以及残留酶检测等方面，也仍缺乏成熟方法。因此，circRNA药物的质量控制体系和监管标准仍有待进一步完善。
图5. circRNA从靶点到药物开发全过程示意图
应用场景
疫苗
由于RNA疫苗采用无细胞制备工艺，便于规模化生产，且外源RNA本身具有一定免疫刺激作用，因此在疫苗开发中具有优势。继北京大学团队开发出新冠circRNA治疗性疫苗后，相关研究已扩展至多种传染病和肿瘤疫苗。
研究表明，表达SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体的circRNA疫苗，其半衰期约为mRNA疫苗的2.5倍，并在小鼠和恒河猴模型中对变异株表现出保护作用。表达RBD抗原的circRNA疫苗可诱导较强的Th1型细胞免疫反应，其血清IgG水平也高于线性mRNA疫苗。
在肿瘤疫苗方面，circRNA疫苗在多种模型中显示出优于线性mRNA的抑瘤效果。此外，通过LEGO技术在circRNA中引入LNAm7G帽等修饰，可进一步提高翻译效率，但也增加了合成难度。
蛋白质替代疗法
与传统重组蛋白或DNA疗法相比，基于RNA的PRT不涉及基因组整合，安全性相对较好；与线性mRNA相比，circRNA在稳定性和制备应用方面也具有一定优势。
目前，circRNA已被用于表达VEGF、NGF和FGF18等蛋白，应用于糖尿病足溃疡、视网膜保护和软骨修复等研究。其中，编码VEGF-A或NGF的circRNA在相关模型中显示出较好的治疗效果。此外，circRNA在心力衰竭、2型糖尿病和杜氏肌营养不良症等疾病中的应用也已有初步探索，但蛋白表达水平的精确调控仍需进一步研究。
肿瘤免疫疗法
相较于线性mRNA，circRNA在肿瘤疫苗及工程化免疫细胞治疗（如CAR-T、TCR-T、CAR-M）中表现出更持久的表达。
肿瘤疫苗方面，编码OVA、IL-12、PTPN2新抗原等的circRNA疫苗在临床前模型中均可诱导抗肿瘤免疫，其中编码PTPN2新抗原的circRNA疫苗在T细胞浸润和抑瘤效果上优于等剂量线性mRNA。
CAR-T与CAR-M方面，LNP递送编码抗HER2或抗CD19 CAR的circRNA可提高蛋白表达，并增强细胞毒性与细胞因子释放；近期构建的CSR修饰CAR-Ms在肾癌模型中也显示出一定疗效。
对于更适用于实体瘤的TCR-T疗法，circRNA在诱导抗原特异性T细胞增殖及维持TCR表达持续时间方面同样优于线性mRNA。
基因编辑
基因编辑治疗可通过纠正致病突变用于遗传病治疗，而以RNA为作用元件的短时编辑系统有助于实现编辑蛋白的瞬时表达，从而降低持续作用带来的脱靶风险。研究表明，环化gRNA及利用工程化circRNA表达Cas9等编辑蛋白可提高基因编辑的稳定性和效率。其主要限制在于编辑蛋白分子较大，而人工合成circRNA长度有限，因此大尺寸circRNA的高效制备仍是当前需要解决的问题。
其他应用场景
表观遗传调控
circRNA在体内可作为miRNA分子海绵、蛋白质支架或调控转录的分子，也可通过翻译蛋白或多肽参与基因表达调控，因此人工设计的circRNA有望作为治疗工具发挥多种生物学功能。
在应用上，人工合成circRNA可作为miRNA海绵，用于拮抗异常升高的致病性miRNA，例如吸附miRNA-122以抑制丙型肝炎病毒蛋白的产生；也可作为蛋白分子海绵，通过结合异常蛋白发挥调控作用，如促进NORAD-PUM复合物形成以改善染色体分离缺陷。此外，递送特定circRNA还可用于疾病干预，例如将circRNA SCAR递送至巨噬细胞线粒体后，可减轻脓毒症模型小鼠的全身炎症反应。
再生医学
circRNA通过两种主要机制参与干细胞分化与凋亡调控：一是作为miRNA“海绵”参与ceRNA网络，二是作为RNA结合蛋白的支架或诱饵，从而影响转录、剪接及翻译过程。例如，特定circRNA可通过结合miRNA解除对下游基因的抑制，调控间充质干细胞或肌肉干细胞的分化状态。此外，circRNA还可与AGO2、FUS、QKI等蛋白相互作用，间接影响细胞命运。
在肿瘤干细胞中，circRNA通过调控Wnt/β-catenin、Notch、Hippo及PI3K/Akt等信号通路，参与维持细胞干性并影响肿瘤发生、进展及耐药性。基于此，利用工程化circRNA调控干细胞分化或干预肿瘤干细胞相关通路，具有潜在的应用价值。
作为适配体
内源性circRNA可形成16–26 bp的不完全互补双链结构，其构象类似于PKR抑制剂。基于此，可设计具有特定结构的工程化circRNA作为RNA适配体，用于结合并调控靶分子。相关策略在阿尔茨海默病和银屑病小鼠模型中显示出一定的治疗效果。
作为功能调节装置和生物传感器
circRNA的闭环结构可延长siRNA在细胞内的稳定性。通过将siRNA反义链环化并与正义链配对，可降低脱靶效应。此外，将核酶或RNA适配体进行环化可实现结构依赖的功能调控：闭环状态下活性受限，开环后功能恢复。基于此，反义环状RNA（AS-circRNA）可用于抑制特定DNA或RNA的功能，circRNA在生物传感器领域也具有应用潜力。
circRNA治疗方法的研究进展
circRNA疗法已进入临床研究阶段，其中PRT进展较快。目前，RXRG001和HM2002已完成IND并进入临床试验，治疗性疫苗TI-0093的IND申请亦已获受理，表明相关药物研发正逐步推进。
同时，多种技术平台正在开发中。例如，oRNA Therapeutics的panCAR™平台结合circRNA与LNP递送，用于在体内生成CAR-T、CAR-NK和CAR-M细胞；Circio的circVec平台可延长RNA稳定性并提高蛋白表达，目前正用于肌营养不良、心肌病及免疫治疗等方向的临床前研究。
临床转化的主要挑战与发展方向
制备工艺与纯化难点
circRNA的制备是其应用的基础，但现有方法通用性有限，产率与纯度受序列结构和长度影响。短链RNA（＜100 nt）多采用酶促连接，但依赖高质量线性前体；化学合成适用于短序列但成本较高，体外转录（IVT）成本较低但存在序列准确性及末端结构问题，需进一步优化。同时，生产过程中残留酶的控制及质量标准仍需完善。
在常用工艺（如PIE）中，还需优化反应体系以支持长链circRNA制备并降低成本。纯化仍是关键难点，通常需结合多种方法，其中Nicked RNA的检测与去除仍存在困难，有待进一步改进相关工艺。
免疫原性与稳定性调控
circRNA的免疫原性仍存在争议。理论上，高纯度circRNA免疫刺激性较低，但外源circRNA仍可能被RIG-I、PKR等识别，且Nicked RNA、dsRNA等生产杂质是诱发免疫反应的重要来源，因此其免疫特性与制备纯度密切相关。
此外，circRNA内部双链结构也会影响免疫反应：短双链结构可抑制PKR，而较长circRNA更易形成dsRNA并激活免疫通路。通过优化长度、结构及序列，可提高稳定性并降低细胞毒性。
在降低免疫原性方面，核苷酸修饰具有一定作用，如m6A可减弱免疫反应并提高稳定性，但并非所有mRNA常用修饰（如m1Ψ）都适用于circRNA。同时，Nicked RNA等杂质的形成机制及控制方法仍需进一步研究。
安全性评价与体内稳定性
circRNA作为新型治疗分子，在临床应用前仍需系统评估其长期安全性、药代动力学、体内分布及递送系统毒性。尽管circRNA具有较高稳定性，但这也可能导致脱靶效应和不良反应持续存在，并干扰细胞内正常的RNA调控网络。
此外，circRNA的体内降解机制及可控降解技术研究仍不充分，缺乏能够精确调节其半衰期的有效手段。其稳定性还受细胞类型及缺氧、炎症等微环境因素影响，这进一步增加了药效和安全性预测的难度。
脱靶效应与免疫风险
circRNA作为miRNA“海绵”时存在脱靶风险，外源高表达circRNA可能通过不完全配对吸附非靶miRNA，干扰ceRNA网络和基因表达。针对circRNA的CRISPR-Cas13或siRNA干预也可能误伤线性同源转录本，并存在效率和脱靶问题。
此外，circRNA还可能在非预期细胞或亚细胞位置发生翻译，产生异常多肽并诱发免疫反应。外源circRNA及其翻译产物也可能被先天免疫系统识别。当前，相关免疫原性评价方法仍不完善，有待建立更系统的检测体系。
多组学解析与方法进展
circRNA的鉴定与功能解析目前仍主要依赖生物信息学工具，但现有方法在准确性、一致性及全长异构体解析方面仍存在不足。未来需结合单细胞转录组、空间转录组及蛋白互作等多组学数据，建立更完善的整合分析框架，以提高对其结构与功能的解析能力。同时，深度学习、合成生物学和量子点标记等技术也为circRNA的设计、递送、追踪与检测提供了新方法，但相关模型性能、数据整合能力及技术适用性仍有待进一步提升。
总结与展望
本文综述了人工合成circRNA的研究与应用进展。随着序列设计、制备工艺和递送系统的改进，工程化circRNA已被用于疫苗、蛋白质替代疗法、肿瘤免疫和基因编辑等方向，部分产品已进入临床研究阶段，在疾病诊断、再生医学和生物传感等方面也具有一定应用潜力。
推动circRNA药物进一步转化，仍需解决若干关键问题，包括完善质量控制标准和监管体系，加强基础研究与跨学科合作，以及建立更通用、简化、低成本的制备与纯化工艺，特别是减少Nicked RNA等杂质的产生并提高去除效率。未来，circRNA工程化的发展可围绕表达调控、结构优化、化学修饰和靶向递送等方面展开，以改善其安全性、稳定性和应用可控性。总体而言，circRNA相关技术仍处于持续发展过程中，其实际应用仍有待进一步研究和验证。
原文链接：
https://wires.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/wrna.70039