环状RNA（CircRNA）的功能机制具有开发为治疗应用的潜力。然而，circRNA制备仍然存在实际挑战。circRNA的形成涉及多种机制，包括外显子反向剪接、I型内含子自剪接和tRNA内含子剪接。
后生动物可通过tRNA内含子剪接产生大量的circRNA，该过程由tRNA剪接核酸内切酶（TSEN）复合物和RNA连接酶协同促进[1]。基于该剪接过程开发的体内表达系统，可产生tRNA内含子环状RNA（tricRNA）[2]，但该系统完全依赖于内源性酶，且环化效率较低。
Jacob团队进一步增强该系统，开发了Tornado表达系统，通过插入具有自切割活性的小核酶（Twister），产生2 ‘，3’-环磷酸和5 ‘-羟基末端，然后利用内源性RNA连接酶连接形成环状结构[3]。但由于该系统中使用了后生动物tRNA序列，用于circRNA药物制备的安全性有待考量。
2025年7月31日，南京鸿明生物赵晟和宜明生物孙秀莲团队在预印本bioRxiv上发表论文：Intracellular auto-circularizing RNA using human tRNA splicing elements。研究通过分析人源tRNA剪接元件对circRNA形成的影响，确定了可进行细胞内自环化的有效人源tRNA序列，并开发了一种通用的新型细胞内自环化（acRNA）框架和策略，可实现基于circRNA的更长效持久、稳定及经济的目的蛋白表达。
acRNA策略设计
研究筛选了人源含内含子tRNA中的剪接位点序列（外显子或内含子），成功地鉴定了可实现细胞内自动环化的有效序列和tRNA类型。这些人源的tRNA剪接位点可与不同的核酶组合使用，体现了acRNA策略的灵活性。
此外，研究还分析了各种因素对circRNA形成的影响，包括人源tRNA剪接元件的长度、核酶的选择、IRES类型和编码基因的长度。经过一系列优化，研究建立了环化效率较高的acRNA通用框架。
图1 基于具有内含子的人类tRNA设计用于蛋白质表达的acRNA策略。
acRNA在多种细胞内高效环化
研究验证了利用PEI转染的acRNA，可在HEK293T、CHO、HeLa细胞中成功精准环化，表明了acRNA的普适性。此外，研究还分析了细胞内RIGI、TNF、EIF2AK2等免疫相关基因的表达，结果表明acRNA的免疫原性低于线性mRNA，与常规PIE法体外合成的circRNA相当甚至更低。
图2 外源circRNA对HEK293T细胞免疫相关基因表达的影响。
acRNA有效表达大分子量蛋白
为了测试acRNA的长序列环化能力，研究构建长约5kb的Cas9-acRNA，并利用LNP递送到HEK293T细胞中。结果显示，Cas9-acRNA可成功进行基因编辑，这表明acRNA可用于表达大分子量的蛋白。
acRNA的长效持续表达
利用LNP转染分别编码荧光素酶的acRNA和mRNA到Jurkat细胞中，acRNA在前48h的蛋白表达量显著低于mRNA，但acRNA的持续表达时间更长。在72~168h内，acRNA的荧光素酶表达量显著高于mRNA。
图3 acRNA通过LNP在Jurkat中蛋白质表达的时间显著长于mRNA。
总结
研究开发了一种基于人源tRNA的新型细胞内自环化策略——acRNA。该策略可以在细胞内生成广泛序列长度范围的circRNA，从而实现更大蛋白质或功能性RNA分子的稳定有效表达，有利于进一步拓宽circRNA的应用。
研究中开发的acRNA策略已申请发明专利（名称：一种基于人源tRNA的自环化RNA；专利号：CN117568337B）。
原文链接：
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.07.28.667085v1.article-info
参考文献：
[1] Cervera A, de la Pena M. Small circRNAs with self-cleaving ribozymes are highly expressed
in diverse metazoan transcriptomes. Nucleic acids research 2020;48(9):5054-64.
[2]Lu Z, et al. Metazoan tRNA introns generate stable circular RNAs in vivo. Rna 2015;21(9):1554-65.
[3]Litke JL, Jaffrey SR. Highly efficient expression of circular RNA aptamers in cells using autocatalytic transcripts. Nature biotechnology 2019;37(6):667-75.