RNA适配体是被设计为具有明确三维结构的短单链寡核苷酸，其通过折叠可高特异性和亲和力地结合广泛的靶标，如小分子，蛋白质，甚至细胞，在诊断和治疗中具有巨大的潜力。
HIV-1的Tat（转录反式激活因子）蛋白可以激活HIV-1基因组转录延伸，在病毒复制和发病机制中起关键作用。Tat RNA适配体可以抑制Tat蛋白的活性，是潜在的抗病毒治疗候选分子[1-2]。然而，线性RNA适配体在细胞环境中稳定性较差，限制了其应用。
环状RNA（circRNA）的独特结构可以抵抗核酸外切酶活性，增强稳定性并延长半衰期。环化的RNA适配体可能可以降低构象柔性，稳定折叠结构，增强靶向结合，作为抗病毒治疗、生物传感和靶向递送等应用的候选分子。
2025年7月16日，埃及扎加齐克大学Omar Eladl团队在Methods上发表研究论文：Circularization enhances RNA aptamer binding and Stability: Evidence from in-cell NMR。研究通过体外环化靶向结合HIV-1 Tat蛋白的RNA适配体，形成环状RNA适配体，并使用细胞内NMR验证了环状RNA适配体增强的Tat结合亲和力和细胞内稳定性，是改善RNA适配体功能的可行策略。
环状RNA适配体体外合成与结构验证
研究使用T4 RNA连接酶对RNA适配体进行环化，并通过非变性PAGE电泳测定和RNase R消化确认环化。
图1 Tat的RNA适配体（34-nt）及使用T4 RNA连接酶环化的RNA。
环状RNA适配体的结合亲和力
Dot Blot结果显示，circRNA适配体（Kd 53.4 pM）与Tat肽（富含精氨酸基序）的结合亲和力比其线性对应物（Kd 587.3 pM）高约10倍。这可能是由于环状RNA适配体构象灵活性降低，从而能维持更有利的、预组织的结合构象。
图2 线性和环状Tat RNA适配体与Tat肽相互作用测定。
环状RNA适配体的结构完整性
体外1D NMR光谱结果表明，线性和环状RNA适配体的亚氨基质子光谱高度相似，化学位移或线形没有显著变化，表明环化没有改变适配体的天然二级结构。
CLEANEX-PM NMR实验进一步表明，与线性形式相比，环状RNA适配体的溶剂交换显著减少，且在关键结合结构域（如茎和凸起区域）中尤其明显，这表明环状RNA适配体碱基配对更紧密和对溶剂的暴露更低。这证实环状RNA适配体结构稳定性更高。
图3 （A）20℃下线性（蓝色）和环状（红色）Tat RNA适配体的体外1D亚氨基质子NMR光谱。（B）在各种混合时间（10-400 ms）记录线性和环状Tat RNA适配体的CLEANEX-PM NMR光谱，以评估质子交换动力学。
体外评估环状RNA适配体的稳定性
为模拟生物环境，研究在HeLa细胞裂解物中孵育了两种RNA适配体，并使用1D NMR在多个时间点跟踪了其稳定性。在8小时内，环状RNA适配体保持稳定并持续可检测；而线性RNA适配体明显降解更快，其信号在4-6小时几乎消失。这些表明环状RNA适配体即使在富含核酸酶的条件下也能保持其结构。
图4 HeLa细胞裂解物中RNA稳定性的基于NMR的监测线性（A）和环状（B）Tat RNA适配体在不同时间点的1D亚氨基质子NMR光谱。
细胞内NMR评估适配体功能
研究还利用细胞内NMR检测了两种RNA适配体在活HeLa细胞内的行为。通过电穿孔递送RNA-Tat肽复合物，并在11个时间点（1-18 h）收集1D亚氨基光谱。线性RNA适配体在3小时开始降解，到10小时完全失去信号。相比之下，环状RNA适配体在10小时内显示出清晰、持续的信号，在12-16小时信号逐渐降低，在18小时仍存在可检测的峰。总之，环化显著改善了RNA适配体的结合性能和细胞内持久性，通过RNA环化增强适配体在活细胞中功能是可行的，这为未来的治疗探索奠定了基础。
图5 在每个时间点与Tat肽复合的线性（A）和环状（B）RNA适配体的1D亚氨基细胞内NMR。
总结
研究通过体外合成环状RNA，显著提高了RNA适配体的性能。靶向HIV-1 Tat环状RNA适配体，与线性RNA适配体相比，明显地增强了适配体有效功能所需的关键性能：结构稳定性改善，结合亲和力增强，及细胞环境中半衰期延长。
研究揭示了环状RNA适配体的治疗潜力，环化RNA为改善RNA治疗剂性能提供了通用解决方案。该成果不仅推动了治疗性RNA设计领域的发展，更凸显了细胞内NMR技术在生理条件下解析RNA功能结构的强大能力。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1046202325001537?via%3Dihub
参考文献：
[1] R. Yamamoto, et al. A novel RNA motif that binds efficiently and specifically to the Tat protein of HIV and inhibits the trans-activation by Tat of transcription in vitro and in vivo, Genes Cells 5 (2000) 371-388.
[2] A. Matsugami, et al. Structural basis of the highly efficient trapping of the HIV Tat protein by an RNA aptamer, Structure 11 (2003) 533-545.