肝内胆管癌（iCCA）是第二常见的原发性肝癌，全球发病率逐年上升。目前，手术是iCCA最有效的治疗方法，但术后5年生存率低且复发率高。此外，对于不可手术切除的iCCA患者，放化疗效果较差；而且，对于可手术切除的iCCA患者，放化疗效果短暂[1,2]。因此，我们迫切需要提高对iCCA进展和转移机制的认识，开发更先进的诊断技术和新的治疗靶点，以提高iCCA患者的生存率。

环状RNA（circRNA）因其共价闭合的环状结构特点而具有稳定性，成为了新型的生物标志物。circRNA具有miRNA和蛋白海绵功能，调控下游相关蛋白的表达，使癌症发生相关的信号通路激活或失活。然而，circRNA在iCCA转移中的潜在机制仍有待进一步阐明。

2023年5月18日，四川大学华西医院肝脏外科研究室袁克非和曾勇团队在Journal of Experimental&Clinical Cancer Research 发表文章CircZNF215 promotes tumor growth and metastasis through inactivation of the PTEN/AKT pathway in intrahepatic cholangiocarcinoma。作者在肝内胆管癌细胞中鉴定到一个新的环状RNA——cZNF215。cZNF215在术后转移的iCCA组织中的表达水平明显上调，并且与iCCA转移和iCCA患者预后不良相关。在体内外过表达cZNF215均能促进了iCCA细胞的生长和转移，而敲低cZNF215具有相反的作用。cZNF215与PRDX1竞争性相互作用，阻断了PRDX1和PTEN之间的关联，导致PTEN/AKT途径失活，最终促进了iCCA的发生和转移。文章解析了cZNF215介导PTEN/AKT途径促进iCCA生长和转移机制，揭示cZNF215可作为潜在的iCCA治疗靶点。

  

 

cZNF215在iCCA组织中高表达，并与iCCA患者预后不良相关

首先，作者通过circRNA-seq分析了术后未发生转移和已发生转移的iCCA组织中circRNA表达谱的差异，再用qRT-PCR方法在iCCA细胞系进行检测，发现有4个circRNA的表达水平显著上调。其中，cZNF215在iCCA细胞系中的过表达水平最显著，值得进一步研究。经过RNase R耐受性测试和FISH实验分析，鉴定了cZNF215环状结构的稳定性及其在胞浆中的定位。在有或无转移的iCCA组织以及邻近的正常组织进行qRT-PCR检测cZNF215的表达水平，发现其在iCCA组织中的表达与正常组织相比显著上调，并且在有转移iCCA组织中的表达水平与无转移的iCCA组别相比显著上调，表明cZNF215可能与iCCA患者的预后不良和癌细胞转移相关。而且，通过Kaplan-Meier曲线分析发现，cZNF215高表达组的iCCA患者的总生存期和无复发生存期较短。

图1 cZNF215在iCCA中的表达分析和患者生存分析

cZNF215在体内外均促进iCCA的生长和转移

作者运用siRNA和构建慢病毒过表达载体对cZNF215进行敲低或过表达，检测其细胞功能。发现敲低cZNF215显著抑制RBE和HuCCT1细胞增殖、侵袭和转移，而过表达cZNF215后观察到相反的结果。为了进一步探索cZNF215在体内的生物学功能，作者分别通过shRNA载体和慢病毒过表达载体构建稳转株细胞，并应用到小鼠肿瘤模型中，用萤火虫荧光素酶标记并通过体内成像系统（IVIS）进行追踪，发现cZNF215的过表达显著促进肿瘤生长和转移，而cZNF215的敲低则抑制了iCCA生长和转移。综上表明，cZNF215在体外和体内均促进了iCCA的生长和转移。

图2 cZNF215在体内外均促进iCCA的生长和迁移

cZNF215通过促进PTEN氧化使PTEN/AKT途径失活

作者采用RNAseq方法研究了cZNF215过表达调控的潜在基因，推测cZNF215可能通过氧化诱导的PTEN/AKT通路失活来促进iCCA的生长和转移。WB实验结果表明，cZNF215过表达确实增强了PTEN氧化和AKT（Ser473和Thr308）磷酸化，而敲低cZNF215则降低了PTEN氧化水平和AKT磷酸化水平。此外，在iCCA组织中进行IHC染色发现，cZNF215高表达组比cZNF215低表达组的AKT磷酸化水平更强。作者进一步探索PTEN在PTEN/AKT途径的介导作用，WB结果显示，过表达PTEN使AKT Ser473/Thr308磷酸化水平显著降低，而敲低PTEN则提高了AKT Ser473/Thr308磷酸化水平。接着，作者通过一系列细胞功能实验发现，NAC（一种调节细胞内氧化还原状态的含巯基抗氧化剂）可以逆转由cZNF215过表达引起的iCCA细胞增殖、迁移和侵袭，而PTEN失活则使cZNF215敲低后仍发生iCCA细胞增殖，迁移和侵袭的情况。总之，以上数据表明，过表达cZNF215使氧化诱导的PTEN/AKT途径失活，从而促进了iCCA的生长和转移。

图3 cZNF215通过促进PTEN氧化使PTEN/AKT途径失活

cZNF215与PRDX1互作使PTEN/AKT途径失活

作者通过RNA pull-down实验和质谱检测，发现PRDX1是cZNF215最可能的RBP，并用RIP实验确认了cZNF215和PRDX1在iCCA细胞中的互作。为了进一步探索PRDX1在iCCA肿瘤发生中的作用，作者敲低或过表达PRDX1后检测PTEN氧化水平和AKT磷酸化水平，WB结果显示，PRDX1的过表达显著降低了PTENox和AKT磷酸化水平，而敲低PRDX1则出现相反的结果。此外，过表达PRDX1减弱了cZNF215过表达对AKT磷酸化的促进作用，而敲低PRDX1挽救了cZNF215诱导的AKT磷酸化的减少。在功能上，过表达PRDX1显著减弱了cZNF215过表达而引起的细胞增殖、迁移和侵袭，而敲低PRDX1则消除了cZNF215敲低对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。综上表明，cZNF215通过与PRDX1相互作用促进氧化诱导的PTEN失活，从而促进了iCCA的肿瘤进展和转移。

图4 PRDX1与cZNF215相互作用使PTEN/AKT途径失活

cZNF215阻止PRDX1和PTEN互作来促进PTEN氧化

作者通过RNA pull-down和RIP实验发现，PRDX1的N端结构域（NTD，1-40 aa）和PRDX1的C端结构域（CTD，157-199 aa）对其与cZNF215的相互作用十分关键。而且，Co-IP实验结果也表明，PTEN主要与PRDX1的NTD和CTD结合。而且过表达cZNF215显著削弱了PRDX1-PTEN的相互作用，而敲低cZNF215则增强了PRDX1和PTEN之间的相互作用，PLA测定结果进一步证实该结果。此外，作者通过cZNF215 pull-down实验发现，敲低PTEN使cZNF215富集了更多PRDX1，进一步表明cZNF215和PTEN与PRDX1的竞争性相互作用。综上表明，cZNF215通过与PRDX1竞争性结合来阻断PRDX1和PTEN之间的互作，从而导致氧化诱导的PTEN失活和AKT磷酸化，最终促进iCCA的进展和转移。

 

图5 cZNF215阻止PRDX1和PTEN之间的相互作用来促进PTEN氧化

敲低cZNF215可增强ipatasertib在体内的抗肿瘤作用

作者通过裸鼠皮下移植瘤实验发现，单独敲低cZNF215或使用ipatasertib可显著抑制肿瘤生长，并且结合cZNF215敲低与ipatasertib治疗能进一步增强对肿瘤生长的抑制作用。而且，在肝原位移植瘤模型和肺转移癌模型中均得到了相似的实验结果。此外，与单独使用ipatasertib治疗相比，敲低cZNF215显著增强了ipatasertib介导的iCCA抑制作用。总而言之，靶向敲低cZNF215以增强ipatasertib的抗肿瘤作用，可能是iCCA的潜在治疗策略。

图6 敲低cZNF215可增强ipatasertib在体内的抗肿瘤作用

总结

cZNF215与PRDX1（NTD和CTD区域）竞争性结合，促进PRDX1与PTEN的解离，使PTEN被氧化诱导，导致PTEN/AKT通路失活，促进iCCA的生长和转移。

图7 cZNF215促进iCCA细胞的生长和转移的分子机制

参考文献：

[1] Sumiyoshi T, Shima Y, Okabayashi T, et al. Chemoradiotherapy for Initially Unresectable Locally Advanced Cholangiocarcinoma. World J Surg. 2018; 42(9): 2910-8.

[2] Cidon EU. Resectable Cholangiocarcinoma: Reviewing the Role of Adjuvant Strategies. Clin Med Insights Oncol. 2016; 12(10): 43-8.

原文链接：

https://doi.org/10.1186/s13046-023-02699-w

分类： circRNA与疾病, circRNA生物学, circRNA疾病标志物, 前沿动态, 最新重要进展, 每周进展汇总, 研究热点跟踪, 肝癌评论

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