环状RNA联合m6A修饰和泛素化机制为中风患者带来福音

缺血性中风（Ischemic Stroke）作为一种常见的脑血管疾病，是我国成年人致残的首要原因。到目前为止，还缺乏促进中风康复和改善长期预后的治疗药物。中风后，缺血边缘区的血管修复可以通过改善血液供应、重构血管周围微环境、促进神经发生及突出形成等多方面促进神经功能恢复，被广泛认为是改善缺血性中风预后的关键修复措施。故研究中风后的血管修复的机制及治疗策略是一个迫切的研究领域，可以使大量患者受益。

环状RNA (circRNAs)是一种内源性非编码RNA分子，具有反向拼接和共价闭合连续环形成的圆形结构。越来越多的证据表明，细胞外囊泡(EV)穿过血脑屏障(BBB)并调控相关基因表达。而有研究发现，circRNA已被证明可以通过增强神经可塑性、抑制神经胶质反应性和外周免疫细胞浸润来改善中风后的运动功能恢复[1]。然而，circRNA是否促进缺血性中风后血管修复及其下游机制尚不清楚。

2023年1月，东南大学医学院姚红红教授课题组在Nature子刊Nature Communications（IF=17.694）发表文章FTO-dependent m6A modification of Plpp3 in circSCMH1-regulated vascular repair and functional recovery following stroke。作者发现EV-circSCMH1能够有效促进缺血性中风模型小鼠与恒河猕猴脑血管修复，并且显著降低中风模型小鼠脑部N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰。机制上，circSCMH1促进脑血管内皮细胞FTO发生泛素化修饰，增加FTO向核内转移，导致血管发育相关基因-脂质磷酸磷酸酶3（lipid phosphate phosphatase 3，Plpp3）的m6A修饰降低，从而抑制了YTHDF2对Plpp3 mRNA的降解，导致Plpp3 mRNA与其编码蛋白LPP3在内皮细胞中的水平增加，促进血管修复。本研究从血管修复层面扩展了circSCMH1促进缺血性中风脑修复的机制，为治疗缺血性中风的新药研发提供了新思路和新靶点。

1、circSCHM1改善缺血性中风恢复期的血管修复

circSCMH1已被报道在中风后可显著增强神经元可塑性和功能恢复。作者为了研究circSCMH1在缺血性中风时血管修复中的潜在参与，通过EVs将circSCMH1传递到血栓形成(PT)的恒河猕猴的大脑。结果显示，circSCMH1可显著增加血管面积、长度及分支数量，增加BrdU阳性细胞以及与血管修复相关的内皮和周围细胞；小鼠模型结果与之一致。总之各项指标均表明，EV-circSCMH1可增加PT模型小鼠梗死周围区域circSCMH1水平，并促进血管修复。而针对于中风模型的血脑屏障完整性的重建，circSCMH1也有着积极的影响。

图1. CircSCHM1改善缺血性中风恢复期的血管修复

2、m6A修饰在中风患者和PT小鼠增加

m6A甲基化参与血管修复已被很多人报道[2]。作者收集了中风患者和非中风的体感觉皮层组织，发现中风患者组织中m6A甲基化水平显著升高，circSCMH1水平较低。作者检测了m6A相关甲基化酶和去甲基化酶的表达，包括METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5，结果发现中风患者组织中FTO水平明显降低，其余基因无明显差异；同样，在小鼠模型上的验证结果与之一致。

图2. m6A修饰在中风患者和PT小鼠增加

3、circSCMH1与FTO结合可减少m6 A修饰

前两部分结果指向：

（1）circSCMH1增强中风后血管修复；

（2）在中风和非中风患者中，circSCMH1与m6A水平之间存在负相关。接下来，作者解析了circSCMH1对中风后m6A甲基化影响的机制。EV-circSCMH1作用小鼠大脑后，PT模型诱导后梗死周围区域总RNA的m6A水平显著降低，而敲低circSCMH1的结果与之相反。

作者研究了circSCMH1对FTO表达的影响。然而，WB结果显示在中风模型中，EV-circSCMH1组和EV-Vector组的FTO水平无显著差异。这提示，circSCMH1可减弱m6A水平，但不影响中风后FTO水平。

先前的研究表明，FTO在细胞核和细胞质中表现出不同的底物偏好，m6A更可能是细胞核中初级聚腺苷酸RNA中的FTO底物29。因此，作者将眼光放到circSCMH1是否影响FTO转位到细胞核。我们首先研究了circSCMH1和FTO之间的相互作用。

通过RNA结合免疫沉淀试验，与阴性对照circHECW2和GAPDH相比，circSCMH1，而不是SCMH1，在ECs中显示出与FTO更强的亲和力。circSCMH1 pulldown实验显示，circSCMH1比circCon富集更多的FTO。作者进一步利用catRAPID算法预测出FTO中的三个区域与circSCMH1具有较高的互作能力，并设计突变和野生型载体进行了验证。综上提示，ECs中circSCMH1和FTO之间存在互作，并减少了m6 A修饰。

图3. circSCMH1与FTO结合可减少m6 A修饰

4、circSCMH1通过泛素化增加了FTO进入细胞核的易位

由于circSCMH1不影响PT小鼠FTO的水平，促使作者进一步检查FTO的核质再分配。结果发现，EV-circSCMH1给药后，PT小鼠FTO水平在细胞质中降低，而在细胞核中增加。这一发现在原发性小鼠大脑微血管ECs和bEnd.3细胞中得到证实。

有研究报道，泛素化可促进FTO从细胞质转移到细胞核，作者接下来研究了circSCMH1对FTO泛素化的潜在影响。circSCMH1过表达显著增加了赖氨酸63（Ub-K63）连接的泛素化水平。UBC13是Ub-K63的E2泛素偶联酶。RNA结合免疫沉淀实验显示，circSCMH1在bEnd中对UBC13具有更强的亲和力。

由于circRNAs被证明可以作为一个支架来增强泛素酶与其靶基因的结合[32]，接下来作者研究circSCMH1是否可以增强FTO与UBC13的结合。免疫共沉淀发现，circSCMH1能够促进FTO和UBC13相互作用。此外，作者发现，UBC13的敲低显著减弱了circSCMH1增强的FTO向细胞核的易位，为此作者做了调控模型如图k所示。综上所述，这些发现表明circSCMH1通过UBC13酶增加FTO的Ub-K63，并促进FTO从细胞质运输到细胞核。

图4. circSCMH1通过泛素化增加了FTO进入细胞核的易位

5、circSCMH1调控PT小鼠梗死周围皮层Plpp3 mRNA的m6A修饰

circSCMH1已被验证可降低PT中风模型中m6A甲基化水平，作者接下来探索下游甲基化基因。火山分布图显示，PT模型诱导后，m6A水平在279个转录本峰值区域显著升高，在898个转录本峰值区域显著降低，EV- circSCMH1转录本显著增加213个峰区，减少499个峰区。使用HOMER算法在EV-circSCMH1和EV-Vector治疗后的PT小鼠中鉴定出高度过度代表的共识序列GGACU motif，这表明PT模型m6A修饰的mRNA成功富集。

通过分析m6A峰的密度，我们发现在PT中风诱导后，m6A修饰水平在梗死周围区增加，EV-circSCMH1处理抑制了PT诱导的m6A修饰。PT模型诱导后，14个转录本的m6A峰值显著增加，EV-circSCMH1处理后抑制这14个转录本出现。两组比较中有8个重叠的转录本，这提示circSCMH1影响了PT后血管修复的靶转录本。

m6A通常在3-UTR中富集，作者进一步研究了m6A甲基化的变化是否影响这8种重叠转录本的水平。通过qPCR和WB检测发现，EV-circSCMH1上调血管生成相关基因Plpp3的表达。进一步分析了Plpp3的m6A修饰水平，结果显示，EV-circSCMH1减弱了Plpp3的m6 A修饰水平，而敲低FTO则可逆转这一结果。这表明m6A修饰介导了circSCMH1增强了Plpp3 mRNA的稳定性。

图5. m6A修饰介导了circSCMH1增强了Plpp3 mRNA的稳定性

6、FTO过表达促进PT小鼠血管及运动功能的恢复

FTO位于circSCMH1的下游。FTO过表达上调PT中风后Plpp3/LPP3的表达及其m6A甲基化，增加血管长度和分支数，增加BrdU+细胞数，脚部故障减少。这表明，在PT中风后，FTO会促进血管和运动功能的恢复。后续作者又使用了AAV载体构建，结果与此一致，脑中风后FTO的特异性表达有助于血管和运动功能的修复。

图6. FTO过表达促进PT小鼠血管修复

小结

综上所述：作者在恒河猴和小鼠上构建中风模型，发现circSCMH1显著促进中风后的血管修复。具体机制在于，circSCMH1促进脑血管内皮细胞FTO发生泛素化修饰，增加FTO向核内转移，导致Plpp3的m6A修饰降低，从而抑制了YTHDF2对Plpp3 mRNA的降解，导致Plpp3 mRNA与其编码蛋白LPP3的水平增加，促进血管修复。

EV-circSCMH1在缺血性中风后血管修复中的增强作用

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-36008-y

参考文献：

[1] Yang, L. et al. Extracellular vesicle-mediated delivery of circular RNASCMH1 promotes functional recovery in rodent and nonhuman primate ischemic stroke models. Circulation 142, 556–574 (2020).

[2] Yao, M. D. et al. Role of METTL3-dependent N(6)-methyladenosine mRNA modification in the promotion of angiogenesis. Mol. Ther.28,2191–2202 (2020).

转载请联系邮箱授权：circRNA@163.com