circRNA可发挥分子海绵作用，可用于诊断和治疗肾细胞癌

肾细胞癌(RCC)是成年人最常见的十大恶性肿瘤之一，近20年来其发病率呈上升趋势。原发性RCC的主要治疗方法是根治性肾切除术。然而尽管及时手术，仍有近三分之一的患者最终会复发。因此，确定调控RCC进展的关键机制对RCC的复发预测和治疗至关重要。

环状RNA (circRNA)具有独特的共价单链闭环结构。高通量测序已经确定许多circRNAs在细胞中具有关键的生理和病理作用。在RCC的发展过程中，某些circRNAs起着不可或缺的作用。例如，cRAPGEF5通过调节miR-27a-3p/TXNIP通路抑制RCC增殖和转移，CircSDHC通过其对miR-127-3p的海绵效应促进RCC进展[1]。然而，RCC的诊断和治疗需要进一步解析circRNA在肾癌中的作用机制。

2022年12月，中山大学附属第一医院肿瘤科张家兴副主任医师在Molecular Cancer发表文章CircNTNG1 inhibits renal cell carcinoma progression via HOXA5-mediated epigenetic silencing of Slug。circNTNG1在RCC中呈现低表达，而过表达circNTNG1对RCC细胞侵袭性具有抑制作用。临床上，circNTNG1表达与RCC分期、Fuhrman分级相关，是RCC患者的独立预测因素。机制上，在RCC中，circNTNG1/ miR-19b-3p/HOXA5轴可以通过DNMT3A/DNMT3L甲基化writer调控Slug的表观遗传沉默，从而干扰RCC的EMT和转移。作者的研究结果为circRNA调控RCC进展提供了证据，并为未来研究RCC的治疗方案提供了几个潜在的治疗靶点。

一、circNTNG1的筛选过程及在RCC中的特性以及低表达

首先作者对5对匹配的RCC患者肿瘤及癌旁组织进行了circRNA测序。由于测序显示更多的circRNA下调，所以作者将关注点放到差异超过2倍且下调的circRNA。随后作者又在RCC上检索了两个GEO circRNA微阵列数据集。在两个数据集中筛选出了16个表达下调的circRNA。二者取交集发现有3个circRNA，其中circNTNG1是下调最显著的circRNA。检测发现，circNTNG1在肿瘤样本中显著下调，其低表达与较差的OS和RFS相关以及临床症状相关。这表明，circNTNG1在RCC中可能具有抑瘤作用。

CircNTNG1(circBase ID: hsa_ circ_0002286)来自1号染色体上的NTNG1基因，由外显子1反向剪接而成。Sanger测序证实了RCC细胞中存在CircNTNG1。背靠背引物验证/FISH定位/R酶耐受处理证明CircNTNG1的成环/定位胞质/稳定性。

图1. circNTNG1的筛选过程及特性

二、CircNTNG1对miR-19b-3p产生海绵效应

circRNA的关键功能之一是它们发挥miRNA海绵机制，从而调节癌症相关基因表达。作者选择了四种算法(SVMicrO, DIANA-microT, ENCORI和miRanda)进行重叠预测，最终筛选出了hsa-miR-9-5p、hsa-miR-19b-3p和hsa-miR-92b-3p。经过双荧光素酶报告基因实验证实，只有miR-19b-3p能与circNTNG1相互作用。随后，RIP发现，circNTNG1和miR-19b-3p都可以与Ago2结合。FISH也显示，circNTNG1和miR-19b-3p在细胞质中共定位。RNA pulldown实验发现，circNTNG1探针组中miR-19b-3p的表达显著下降。而过表达circ-NTNG1亦导致miR-19b-3p显著下调。

miR-19b-3p在肿瘤组织中高表达，与低OS和RFS显著相关，其主要调控功能是离子结合和核酸结合。作者应用miR-19b-3p模拟物促进RCC细胞迁移和侵袭，而抑制剂则相反，这体现了miR-19b-3p的致癌能力。

图2. CircNTNG1对miR-19b-3p产生海绵效应

三、miR-19b-3p通过抑制HOXA5的表达调控RCC的进展

在circNTNG1/miRNA/mRNA相互作用网络中，预测出20个下调最显著的mRNA中，只有NR3C2、PPARA、SOX6、SMARCA2、HOXA5和SATB1与核酸结合活性相关，这与miR-19b-3p的预测功能一致。应用miR-19b-3p模拟物的RCC细胞系769P进行体外验证后，HOXA5成为最有希望的下游靶点。双荧光素酶报告实验验证，miR-19b-3p与HOXA5结合。并且，miR-19b-3p mimic/inhibitor亦能抑制/促进HOXA5的表达。HOXA5是HOXA家族中独特的RCC抑癌基因。随后作者发现，过表达HOXA5可降低RCC细胞的迁移和侵袭能力，敲低则相反，但是无论过表达还是敲低，都不改变增殖能力。体外实验结果亦显示，在过表达HOXA5可减少肺定植，肺转移灶明显减少。

图3. miR-19b-3p通过抑制HOXA5的表达调控RCC的进展

四、HOXA5通过下调SNAI2 (slug)抑制上皮间充质转化(EMT)激活

为了确定HOXA5调控的下游通路，作者进行了GSEA分析。通过TCGA (ccRCC)数据集分析发现，EMT通路失活在HOXA5高表达组中富集。由于EMT通路是肿瘤进展[2]的重要调节因子，作者推测HOXA5通过抑制EMT通路抑制RCC转移。进一步探索发现，HOXA5与EMT驱动因子Slug的表达呈现负相关。这些结果表明，HOXA5作为RCC中的抑癌基因，可能通过抑制EMT驱动基因Slug发挥作用，进而抑制肿瘤转移。

然而，HOXA5如何抑制Slug？GO分析表示，HOXA5是一种典型的DNA结合蛋白，与转录活性相关。因此，HOXA5可能作为转录抑制因子来实现对Slug的抑制作用。结合JASPAR数据库和序列分析，作者发现Slug的启动子区域包含一个被HOXA5识别的特定序列。此外，参考肝癌HOXA5 ChIP-seq数据集(GSE170384)，在Slug启动子区域发现了几个峰值。在此基础上，设计了针对Slug启动子区域的引物，HOXA5 ChIP-qPCR实验中该引物被显著富集。并且，在HOXA5过表达后，随着Slug的重新表达，蛋白质和细胞的迁移/侵袭能力也发生了相应的变化。这些结果证实了HOXA5与Slug的启动子区结合并抑制其表达，从而调节EMT。

图4. HOXA5通过下调slug抑制EMT激活

五、HOXA5招募DNMT3A，增加Slug启动子区DNA甲基化水平

在确定HOXA5与Slug之间呈现负相关后，作者进一步研究HOXA5与Slug启动子序列之间的相互作用。Slug mRNA表达与其启动子甲基化水平呈负相关。并且，在Slug促进运动区域，有两个CpG岛靠近hoxa5结合位点。因此，作者推测HOXA5可能通过增加其启动子区域的甲基化水平来抑制Slug的表达。为此，根据CpG岛设计了3组引物。在过表达HOXA5前后对769P细胞进行MeDIP，发现甲基化水平在所有三个位点都有所增加，并且引物A和B检测到更明显的富集。在人类细胞中，有三种主要的DNA甲基化writer：DNMT3A, DNMT3B和DNMT1[3]。作者发现HOXA5和DNMT3A存在相互作用。此外，使用覆盖HOXA5结合位点的引物的ChIP-qPCR显示，HOXA5过表达后，DNMT3A向Slug启动子区域的募集显著增加，RCC细胞迁移/侵袭能力恢复。这些结果表明，HOXA5通过招募DNMT3A形成复合物并随后增加Slug启动子的甲基化水平来抑制Slug的表达。

图5. HOXA5招募DNMT3A，增加Slug启动子区DNA甲基化水平

六、circNTNG1/miR-19b-3p/HOXA5调控轴的完整性

circNTNG1/miR-19b-3p/HOXA5调节轴的成员是紧密相关的。为了进一步研究该轴的完整性，作者进行了一系列正向和反向实验。应用miR-19b-3p模拟物或抑制剂后，HOXA5、Slug和EMT标记物的表达水平出现了相应的变化。此外，在circNTNG1过表达后添加miR-19b-3p模拟物逆转了HOXA5和Slug蛋白表达的变化以及RCC细胞的迁移和侵袭表型，而过表达HOXA5可逆转这些结果。同样，在小鼠尾静脉注射转移瘤模型中，miR-19b-3p可以消除circNTNG1过表达的肿瘤抑制作用，恢复肺肿瘤定植能力。同样，过表达HOXA5后，miR-19b-3p的作用被抑制。综上所述，circNTNG1/miR-19b-3p/ HOXA5轴存在于RCC中，并调节RCC的进展。

图6.circNTNG1/miR-19b-3p/HOXA5调控轴的完整性

原文链接：

https://doi.org/10.1186/s12943-022-01694-7

参考文献：

[1] Chen Q, et al. CircRNA cRAPGEF5 inhibits the growth and metastasis of renal cell carcinoma via the miR-27a-3p/TXNIP pathway. Cancer Lett. 2020; 469:68–77.

[2] Ribatti D, Tamma R, Annese T. Epithelial-mesenchymal transition in Cancer: a historical overview. Transl Oncol. 2020;13(6):100773.

[3] Jeltsch A. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases. Chembiochem. 2002;3(4):274–93.