circRNA具有闭环结构所赋予的高稳定性，且其表达常呈现疾病/组织特异性，并参与肿瘤发生发展过程，因此被视为潜在理想的生物标志物。然而在真实实验与临床样本中，circRNA丰度低且处于复杂基质（如血清、组织）背景下，导致捕获与定量困难；现有RT-qPCR、测序与FISH等方法流程相对繁琐、对设备与操作要求较高，且难以实现活细胞内circRNA的原位成像、动态表征。因而，亟需兼具高灵敏定量与活细胞成像能力的新型检测策略，以弥补circRNA临床转化中的关键技术缺口。
近日，宁波大学材料科学与化学工程学院质谱技术与应用研究院联合上海交通大学医学院附属瑞金医院胸外科在Analyst发表研究论文：Sensitive detection and accurate bioimaging of circRNA based on sponge amplification using a DNA tetrahedral nanoprobe。
这项研究利用circRNA天生的miRNA“海绵效应”，设计了一个无需转染剂即可进入细胞的DNA四面体荧光纳米探针（DTNP）。它既能实现circRNA的超灵敏定量检测（LOD为79pM），又能在活细胞中进行原位成像，为肿瘤相关circRNA的临床诊断提供了一个更可落地的新方法。
DTNP的构建与检测机制
研究团队选取在多种癌症中异常表达的 circMTO1 作为靶标，构建了基于 DNA 四面体（DTNP）的荧光探针。DTNP 由 5 条 DNA 自组装形成，其中三个顶点连接淬灭基团 BHQ2，并将带 Cy3 的 miRNA-760 作为识别序列固定于四面体上。无靶标时荧光被淬灭；当 circMTO1 与 miRNA-760 特异配对后，荧光被释放，实现由 “OFF” 到 “ON” 的信号转变，从而在临床样本和活细胞中实现对 circMTO1 的精准检测。
图1 DTNP的构建及其在活细胞中检测CircRNA并进行原位成像的机制
DTNP的结构表征与检测性能验证
实验结果表明该探针成功构建并具备预期结构特征。凝胶电泳显示DNA四面体按设计完成逐步组装，AFM、TEM及DLS表征进一步证实其粒径约15nm、形貌规整且分布均一。性能评估显示体系检测背景低、信噪比高，靶标加入后荧光响应显著增强；在优化条件（pH8.0、37°C、反应75min）下，检测下限达到79pM。与此同时，含1–3个碱基突变的序列引发的荧光信号明显减弱，表明该平台具有单碱基分辨能力，兼具高灵敏度与良好特异性。
图2 DTNP构建成功的验证
图3 DTNP在缓冲液体系中的性能验证
图4 DTNP在优化缓冲液体系中的性能验证
复杂样本与临床/活细胞验证
面向临床转化的结果进一步验证了DTNP的可行性：其在10%血清中保持良好稳定性与抗干扰能力（LOD为84.5pM）。在细胞裂解液中，HeLa信号最高、LO2高于A549/HepG2，提示circMTO1在肝癌下调而在宫颈癌上调，该趋势与既往研究一致并经RT-qPCR证实；HeLa细胞数在10²–10⁵范围内与荧光呈线性相关（R²=0.991，LOD=100细胞），其余细胞系检测下限差异可能由表达水平不同所致。临床NSCLC组织中circMTO1明显低于健康组织，结合DTNP在活细胞内的无需转染试剂原位成像结果与qPCR数据的高度一致性，共同构成“体外定量—细胞原位—临床组织”相互印证的闭环证据链，支持其诊断与分型潜力。
图5 DTNP与10%血清中不同浓度的CircRNA类似物之间的线性关系
图6 DTNP在不同细胞裂解液中的荧光强度及RT-qPCR验证
图7 DTNP在肺癌患者及癌旁正常组织中检测circMTO1的性能验证
图8 DTNP应用于活细胞中circMTO1原位成像
总结
该研究利用circRNA的miRNA海绵效应实现无酶信号放大，降低体系不稳定性与操作复杂度；DNA四面体平台同步提升探针稳定性、入胞效率并降低背景；检测与活细胞成像的一体化，使circRNA从静态定量走向原位表征。DTNP将低丰度circRNA的高灵敏检测与活细胞可视化整合于单一体系，提升了时空解析能力，为肿瘤相关circRNA的研究与临床应用提供了可行路径。
原文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2025/an/d5an00611b