12月6日，Molecular Therapy杂志在线发表了加拿大多伦多大学杨柏华教授和广东省人民医院王晟为共同通讯作者的文章，报道发现circYAP通过结合TMP4和ACTG抑制心肌纤维化。小鼠TAC模型心脏中过表达circYAP可显著抑制纤维化作用 [1]。
心肌纤维化是心脏肥大的重要病理特征，本文作者发现YAP基因来源的一种circRNA（hsa_circ_0002320，circYAP）在心肌纤维化中下调，小鼠TAC模型中过表达circYAP可抑制纤维化过程。机制方面，circYAP通过与TMP4和ACTG相互作用促进TMP4和ACTG的结合，抑制微丝聚集，进而抑制纤维化聚集。下面就一起来学习一下本文的内容：
如何发现circYAP与心肌纤维化的关系？
在另一项研究中，作者的团队通过9例心脏标本的高通量测序发现来自YAP基因的circRNA。目前已知的由YAP基因来源的circRNA共有15种，在这9例心脏组织的测序结果中共发现了其中的三种，其中hsa_circ_0002320是表达丰度最高的，为方便表述，本文中用circYAP的称呼代表hsa_circ_0002320分子。在小鼠的多种组织标本中检测表明，circYAP在心脏组织中是高表达的。此外，从21例健康对照心脏组织和104例心肌肥厚心脏病例中QPCR检测circYAP表达，结果显示，circYAP在心肌肥大组显著下调。
TAC小鼠心脏中过表达circYAP可抑制心脏肥大表型
图2 TAC小鼠心脏过表达circYAP抑制心肌肥大表型（[1]）
过表达circYAP抑制心肌纤维化
腹膜注射过表达circYAP在能够有效实现在心肌细胞中表达circYAP分子。HE和天狼星红（Sirius Red）染色，Masson Trichrome染色检测心肌组织结构和纤维化状态。结果显示，TAC模型小鼠心脏组织出现明显的纤维化状态，但过表达circYAP后纤维化受到抑制。临床标本中检测I型和III型胶原的情况，结果显示心肌肥大标本中两种纤维的含量均有显著升高。标本群体中分析每个标本circYAP表达与两种胶原含量的相关性显示circYAP的表达与I型和III型胶原的含量显著负相关。
circYAP抑制I型和III型胶原基因表达
进一步，作者QPCR检测了TAC模型中过表达circYAP对I型和III型胶原基因表达的影响。结果表明，TAC模型中I型和III型胶原基因的表达显著升高，但过表达circYAP后两种胶原基因表达下降。与此类似，TGF-β，NGF，CTGF的表达变化也有相同的趋势。在心脏成纤维细胞（MCF）和心肌细胞（HL-1，AC16）中分别过表达circYAP，均可抑制III型胶原基因表达。体外TGF-β刺激心肌MCF细胞可以促进I型和III型胶原基因表达，但如果过表达了circYAP，这一效应可被阻断。
circYAP与TMP和ACTG结合
为探索circYAP在心肌细胞中抑制纤维化的机制，作者通过RNA pull-down实验捕获和鉴定相互作用的 蛋白。结果表明TMP4和ACTG是相互作用最强的两个蛋白。MCF和HL-1细胞中构建过表达circYAP和不成环的对照。分别用ACTG，TPM4的抗体进行RIP-QPCR实验，结果表明两种细胞中ACTG和TPM4均与circYAP相互作用。小鼠心肌组织中也验证了这一相互作用。作者之前曾报道circYAP可以结合YAP的mRNA，为排除mRNA是否与这些蛋白存在相互作用的问题，作者通过RNase R消化实验进行分析。在小鼠心肌组织中利用RNase R消化了YAP的mRNA后，circYAP依然可以结合ACTG和TPM4，说明这一相互作用是不依赖YAP的线性mRNA的。TAC模型中，不过表达的条件下，circYAP与ACTG和TPM4的相互作用显著下降，但过表达后恢复。circYAP是与ACTG和TPM4其中的一个结合的，还是一起结合的？为分析这个问题，作者通过在binding实验前或实验后进行RNase A或RNase R的处理，分析circYAP的结合是否影响ACTG和TPM4的结合。结果显示，如果在Binding实验前就进行RNase消化，可削弱复合物形成的效率，说明circYAP具有促进复合物形成的作用。
circYAP与TMP4和ACTG结合的机制
为进一步分析circYAP结合TMP4和ACTG的机制，作者首先通过Docking分析预测circYAP分别与TMP4和ACTG结合的位点，然后分别构建突变体。Pull-down实验验证突变后结合对应蛋白的情况，结果表明预测得到的结合位点突变后对应的蛋白结合效应显著降低。此外，分别设计结合位点的block分子，pull-down和RIP实验验证相关的相互作用情况。相关结果验证了circYAP与TMP4和ACTG的相互作用位点。
circYAP结合TMP4和ACTG，抑制肌动蛋白聚集
肌动蛋白聚集形成微丝是纤维化的重要机制，生理条件下TPM蛋白可以结合并抑制肌动蛋白的聚集。过表达circYAP可显著抑制肌动蛋白的聚集。干扰PTM可促进心脏成纤维细胞迁移率，而干扰ACTG抑制这一过程。过表达circYAP也可以抑制心脏成纤维细胞迁移率。过表达野生型circYAP结合ACTG或TPM结合位点的circYAP突变体不具有这一功能。TGF-β处理后I型和III型胶原蛋白的表达结果也表明，过表达野生型circYAP可以抑制表达，但突变型没有这个作用。TAC模型小鼠的心肌裂解液分析肌动蛋白聚集情况，结果显示TAC模型的心脏裂解液肌动蛋白聚集效率明显升高，但过表达circYAP后，心脏裂解液的肌动蛋白聚集效率恢复到正常水平。
circYAP抑制心肌纤维化进而抑制心肌肥大的作用机制
临床心肌肥大患者往往伴随心肌纤维化，这类病人心肌细胞中circYAP表达显著下降。体内circYAP可以结合TPM4和ACTG，抑制肌动蛋白的聚集，进而抑制纤维化进程。当circYAP降低后，肌动蛋白聚集效率增强，纤维化加速，最终导致心肌肥大病理特征。
本文的工作进一步证明了circRNA可以通过结合蛋白等方式参与生理和病理进程，是与线性mRNA完全不同的作用机制，值得circRNA研究的同行借鉴学习。
参考文献
Molecular Therapy (2021), doi: https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2020.12.004.