2020年6月10日，郑州大学第一附属医院的殷德涛、刘金波和孙振强为共通讯作者在Molecular Cancer（IF=10.679）杂志上发表了一篇题为“The role of N6-methyladenosine (m6A) modification in the regulation of circRNAs”的综述，总结了m6A修饰在circRNA调控和功能中的作用。此外，还讨论了该领域的潜在应用和未来方向（[1]）。
N6-甲基腺苷（m6A）是真核细胞中RNA最丰富的修饰方式，可调节RNA的转录、加工、剪接、降解和翻译。环状RNA(circRNA)是一类单链共价闭合的RNA分子，以进化的普遍性、多样性、稳定性和保守性为特征。越来越多的证据表明，m6A修饰和circRNA均涉及到多种疾病的发病机制，如癌症、神经疾病、自身免疫性疾病和不孕不育。最近，已发现富集的m6A修饰具有调节circRNA生物学功能的重要作用。在这篇综述中，作者总结了m6A修饰在circRNA调控和功能中的作用。此外，还讨论了该领域的潜在应用和未来方向。
1 m6A的Writer、Eraser和Reader
m6A的调控功能主要由“Writer”、“Eraser”和“Reader”三种不同功能的酶调控。功能上，Writer、Eraser和Reader分别介导m6A的修饰、去修饰和读取识别。m6A的Writer是参与甲基转移酶复合物形成的蛋白质，包括甲基转移酶样3和14蛋白(METTL3和METTL14)及其辅助因子WT1相关蛋白(WTAP)、RNA结合基序蛋白15 / 15B（RBM15 / 15B）、VIRMA和ZC3H13。METTL3作为发现最早和最广为人知的组分，是一种S-腺苷甲硫氨酸(SAM)结合蛋白，并在多种真核生物中高度保守。值得注意的是，METTL3除了以复合物的形式发挥Writer功能外，METTL3的同系物（METTL16）已被鉴定为一种新的独立RNA甲基转移酶，它可以调节细胞SAM水平和甲基化U6小核RNA。
m6A修饰的动态可逆过程也依赖于某些去甲基酶（Eraser）。脂肪和肥胖相关蛋白（FTO）是首次发现催化m6A去甲基化的蛋白质，它通过与自身同源物(ALKBH5)合作来维持转录组中m6A水平的平衡。ALKBH3是新发现的一种去甲基化酶，相比mRNA或rRNA，更倾向于在tRNA上执行其去甲基功能。此外，ALKBH3也是一种公认的DNA修复酶，并有可能作为肿瘤的分子标志物。m6A修饰的RNA需要一类可变的RNA结合蛋白作为Reader，从而执行特定的生物学功能。YT521-B同源性（YTH）结构域家族的蛋白质，包括YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3，它们具有保守的m6A结合域，是人类中前五个特征化的m6A Reader。异质核糖核蛋白（HNRNP）家族是另一类可作为m6AReader的RNA结合蛋白（RBP）组。异质核核糖核蛋白A2 / B1（HNRNPA2B1）可特异性识别m6A修饰的RNA，并在m6A依赖的核RNA加工中充当调节分子。相反，HNRNPC和HNRNPG不能直接与m6A位点结合，但它们可以通过识别结合m6A依赖的结构开关来介导含有m6A修饰转录本的选择性剪接过程。翻译起始因子3(eIF3)通过与mRNA 5‘-UTR中m6A结合来启动翻译过程，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BP，包括IGF2BP1/2/3)通过m6A依赖性方式使靶基因和相应的翻译更加稳定。此外，富含脯氨酸的卷曲螺旋2 A（Prrc2a）是一种新型m6A Reader，通过m6A依赖性方式结合于编码序列(CDS)的GGACU基序来稳定mRNA表达。
m6A修饰的动态可逆性与机体的正常生理活动密切相关。研究表明，m6A修饰的mRNA或非编码RNA（主要是miRNA和lncRNA）在精子发生、T细胞稳态，果蝇性别选择、热休克反应、重编程和多能性以及其它过程中起关键作用。考虑到m6A修饰在调节基因表达和各种生物学功能中的重要性，m6A水平失调会导致多种疾病，特别是对某些癌症。最近有研究表明，在急性髓系白血病(AML)、肝细胞癌(HCC)、胶质母细胞瘤干细胞(GSC)、乳腺癌、肥胖、不孕、自身免疫性疾病和神经疾病中，可检测到m6A修饰异常和m6A调节蛋白的异常表达。
图1 动态可逆的m6A修饰过程
2 circRNA的特性、调控机制及其生物学功能
根据来源，可以把circRNA可分为四大类：外显子circRNA(EcircRNA)、内含子circRNA(ciRNA)、外显子-内含子circRNA(EIciRNA)和其它circRNA，可来源于病毒、tRNA、rRNA和snRNA等。circRNA分布广泛，可以在大多数生物中检测到circRNA，包括古细菌、植物、寄生虫和大多数哺乳动物。先前有研究表明，在人类成纤维细胞中，有超过25,000种不同的RNA可以产生相应的circRNA。此外，同一基因还可以通过交替环化产生不同的circRNA，从而导致circRNA的多样性。另一个重要特征是，circRNA对核酸外切酶存在抗性，因此它们比线性RNA更加稳定。不同物种之间的同源性研究表明，circRNA在物种之间的进化中高度保守。人和小鼠的circRNA同源性水平达到20％或更高，而猪和小鼠的circRNA同源性在15％至20％之间。最后一个也是最实用的一个特征是，circRNA的表达水平在不同组织和不同生长阶段中有所不同，这也是理想疾病生物标记物的基本特征。人和小鼠不同组织的表达谱表明，神经组织(尤其是脑组织)比其它组织含有更丰富的环状RNA，并且随着脑的发育，circRNA的表达水平逐渐上升。
在挖掘circRNA特征的基础上，越来越多的研究集中于circRNA的调控机制。最典型的作用机制是circRNA作为竞争内源性RNA(ceRNA)来执行特定功能。含有miRNA反应元件(MRE)的circRNA可以与特定的miRNA结合，来负向调节miRNA活性，因此circRNA也被称为“miRNA海绵”。第一个被定义为“ miRNA海绵”的circRNA是ciRS-7，在2013年，由Thomas B团队在人和小鼠的大脑中首次发现。 此外，circRNA还可以与某些RBP相互作用来执行特定的生理功能。在大多数情况下，这些circRNA充当“分离剂”的作用来抑制RBP的功能或转运。circEIF3J和circPIAP2主要定位于细胞核，它们可以与U1 snRNP相互作用来促进其亲本基因的转录。有趣的是，一些位于胞质的circRNA也同样具有相似的蛋白结合能力。circFoxo3可以与DNA结合抑制因子1(ID-1)、E2F转录因子1(E2F1)、粘着斑激酶（FAK）和缺氧诱导因子1亚基α（HIF1-α）相互作用，将这些组分一起保留在胞质中。最近有研究表明，某些circRNA可以翻译成蛋白质。在没有游离5‘端的情况下，circRNA的翻译不能由传统的帽子依赖性调控元件启动，因此需要内部核糖体进位点(IRES)或其它元件来激活非帽子依赖性的翻译途径。为了支持这一假设，Wanget等人在circRNA中设计了IRES，然后成功地在293T细胞中检测到由该circRNA翻译的相应蛋白。最近，其它研究发现，m6A修饰在许多circRNA中大量存在，这种甲基化修饰能够以类似于IRES的方式驱动circRNA翻译。
虽然circRNA研究还处于起步阶段，但已证实circRNA与各种疾病的发生、发展和预后密切相关。最近有研究表明，在各种癌症、神经心理疾病、
自身免疫性疾病、不育症、糖尿病、肾病和关节炎等疾病中存在circRNA的表达失调，但是在这些失调的circRNA中只有少数具有生物学功能。一些研究认为这可能与circRNA的表观遗传修饰有关，其中m6A修饰是被最先考虑的因素。
图2 circRNA和m6A修饰在多种疾病中的作用
3 m6A修饰在circRNA调控中的作用
目前的研究表明，m6A失调会导致多种疾病，尤其是某些癌症。一般来说，m6A具有双向调节作用。在多数情况下，m6A失调有助于肿瘤的发生和进展。然而，最近的研究表明，m6A水平异常也会导致肿瘤抑制。因为m6A主要通过影响RNA代谢来发挥功能，近年来，多数研究的注意力都集于m6A修饰的mRNA上，很少有研究涉及m6A修饰的ncRNA，特别是circRNA。在这里，作者总结了m6A修饰在circRNA调控和功能中的作用。
3.1 m6A修饰调控circRNA翻译
最近的研究表明，某些circRNA具有蛋白编码潜力，并且翻译过程可以由m6A驱动。通常，真核细胞的RNA翻译需要真核翻译起始因子4F（eIF4F）复合物的参与，它由三个启动因子组成：eIF4A（解旋酶蛋白）、eIF4E（m7GReader）和eIF4G（支架蛋白）。在mRNA上，这些转录起始元件定位于5’端的帽子结构，因此将其定义为帽子依赖性途径。由于缺乏游离的5’末端，这种传统的帽子依赖性途径在闭合环状转录物中不起作用。因此，一些非帽子依赖性翻译启动机制被提出来，如IRES依赖性途径和m6A依赖性途径，用于解释一些circRNA的蛋白编码潜力。IRES是介导核糖体和RNA结合从而启动翻译的序列。据报道，由IRES驱动的circRNA翻译包括，在肌肉生成中的circZNF609 、在胶质瘤发生中的circSHPRH和circFBXW7、蝇头提取物中的circMbL和在肝癌生长中的circβ-catenin。
然而，Yang等人最近的一项研究开阔了人们对人类转录组编码领域的认知。在细胞对环境压力的反应中，证实了m6A驱动的翻译途径。在这项研究中，检测到包含m6A模序的circRNA被翻译，并验证了翻译效率由m6A水平调控。从机制上讲，m6A驱动的翻译是由eIF4G2和m6AReaderYTHDF3启动，它可以被甲基转移酶METTL3 / 14增强，而被去甲基酶FTO抑制。此外，还检测了一些内源性circRNA的m6A水平，结果表明circRNA中的m6A模序十分丰富。就整个人类转录组而言，具有编码潜能的circRNA存在
m6A修饰并不罕见。最后，选择circRNA反向剪接区域编码的33个内源肽段进行功能分析。遗憾的是，尽管这些circRNA在面对细胞应激时的翻译效率确实有所提高，但并未检测到功能的富集。
值得注意的是，这两个非帽子依赖性翻译途径可能不是独立的发挥作用。Legnini等人重新分析了成肌细胞中m6A-Seq和免疫沉淀数据，并将这些数据与其它m6A免疫沉淀（IP）结果相结合。结果表明，在IRES驱动的蛋白编码circRNA circZNF609中检测到m6A的富集，这表明两个非帽子依赖性途径可能存在相互联系。
3.2 m6A修饰促进circRNA降解
由于闭合环状结构，circRNA比其亲本线性RNA更加稳定，因为它们不是外来化学物质或核酸外切酶的主要靶标。许多circRNA表征有关的研究已证实这一点。然而，circRNA是如何被降解，以及什么因素会调控其降解途径，在很大程度上还不清楚。以前有研究表明，具有大约完全互补miRNA靶点的circRNA可以通过Ago2依赖性方式进行降解，但是这种方式并不适用于没有miRNA海绵功能或特殊miRNA靶点的circRNA。另一项研究发现，GW182的缺失会导致内源性环状转录本的积累。遗憾的是，GW182对circRNA的核转运影响不大，它在细胞质中的功能也未完全阐明，因此需要其它研究来解释circRNA的降解。
内切酶切割途径是m6A驱动RNA降解的途径之一。circRNA作为非编码RNA研究领域中的一颗新星，m6A修饰的circRNA可以通过YTHDF2-HRSP12-RNaseP/MRP轴被核酸内切酶所降解。HRSP12是介导YTHDF2（m6AReader蛋白）和RNase P / MRP（核酸内切酶）形成YTHDF2-HRSP12-RNase P / MRP复合物的衔接蛋白，其中以YTHDF2作为指导。当YTHDF2识别m6A修饰的circRNA时，无论其是否占据HRSP12结合位点，RNaseP / MRP都始终执行其核酸内切酶功能。HRSP12结合位点存在的唯一差别是，它极大地提高了核酸内切酶的切割效率。随后，m6A修饰的circRNA被选择性下调，随之而来的是circRNA生物学功能的变化。因此，可以得出结论，m6A可以通过调节circRNA降解来影响其生物学功能。
图3 m6A修饰可调节circRNA的翻译和降解
3.3 m6A修饰的circRNA在先天免疫中的作用
先天免疫(又称非特异性免疫)是机体在发育和进化过程中形成的天然免疫防御能力。它在控制和解决组织损伤的炎性反应中起着决定性作用。最近的一项研究发现，先天免疫可以由外源性和内源性RNA不同地激活。由RNA聚合酶II直接产生的所有转录本均带有m7G帽，RIG-I（也称为DDX58）可以在它的5’端感应到三磷酸，这也是免疫监控的基本要素。由于闭合环状结构，circRNA被认为能够从终端监控系统中逃逸。然而，最近的研究表明，一些外源性circRNA的入侵仍然会导致强有力的先天免疫反应，从而对病毒感染起到保护作用，而内源性circRNA会形成16-26 bp不完全配对的RNA双链以抵抗天然免疫中的双链RNA(dsRNA)活化蛋白激酶(PKR)。这里有一种解释来描述免疫系统如何将内源性和外源性circRNA相区分，即免疫系统通过m6A修饰来区分内源性和外源性circRNA。
Y. Grace等人的研究显示，由ZKSCAN1内含子产生的circRNA（circSELF），不同于circFOREIGN，不能进行自动剪接，它的产生与WTAP和KIAA1429（m6AWriter）以及YTHDF2和HNRNPC（m6AReader）相关。进一步的研究发现，这两个circRNA中存在不同水平的m6A修饰，高丰度的m6A修饰存在于circSELF中。circSELF可以通过YTHDF2介导的抑制来逃避先天免疫监视，这与最近的一项研究结果一致，该研究表明YTHDF蛋白可以募集m6A修饰的RNA，并通过其N端无序结构域来诱导其进入相分离凝析油中。这些结果表明人circRNA可以被共价m6A标记，这对于逃避先天免疫监视是至关重要。
3.4 m6A修饰的circRNA在肿瘤中的作用
由于m6A和circRNA都与肿瘤密切相关，很自然地推测，m6A修饰可能调节多种肿瘤中circRNA的功能。在此，作者简要回顾了m6A修饰的circRNA与肿瘤相关的最新研究。
作为全球发病率第三和死亡率第二的恶性肿瘤，大肠癌是人类健康的主要威胁，尤其是在中国。临床上，大肠癌的肝转移是最常见的器官转移，会导致5年以上的预后不良。最近，Chen等人发现，circNSUN2的m6A修饰通过促进其胞质输出并形成circNSUN2 / IGF2BP2 / HMGA2 RNA-蛋白质三元复合物来稳定HMGA2 mRNA，从而促进大肠癌的肝转移。HMGA2，一种高迁移族AT-hook 2，已被广泛证实与大肠癌的发展相关。这些结果阐明m6A修饰可以影响circRNA和RBP之间的相互作用。
宫颈癌是妇科常见的癌症，预后相对较差，几乎所有的宫颈癌都是由致癌型人乳头瘤病毒(HPV)引起的。circE7是由HPV产生的一种可编码癌蛋白的circRNA，它与CaSki宫颈癌细胞的体内外生长密切相关。有趣的是，m6A修饰被检测到并证实它是circE7蛋白编码的必要基序，这与上述提及m6A修饰促进circRNA翻译和帮助外源circRNA逃避免疫监视的观点相一致。此外，circE7并不是m6A修饰的特殊例子。另一项研究在人类胚胎干细胞（hESC）中鉴定了1000多种经m6A修饰的circRNA，同时表明在HeLa细胞中m6A修饰的circRNA也很丰富，这表明m6A修饰具有广泛的调控作用。
除了直接修饰circRNA，m6A还可以通过改变下游分子的甲基化状态来影响circRNA功能。作为Hippo途径下游的主要效应因子，YAP与各种肿瘤的发生和发展密切相关。在肝细胞癌中，circ_104075可以吸附miR-582-3p，从而减轻其对YAP的抑制，进而促进肿瘤的发生。YAP 3‘-UTR的m6A修饰可以促进其与miR-382-5P的相互作用，进而抑制YAP表达。之后，circ_104075对肝细胞癌的促进作用被抑制。此外，m6A水平、IRES和开放阅读框（ORF）组合的生物信息学预测可以表明，circPVRL3在胃癌中的蛋白编码潜力。
图4 m6A修饰的circRNA在先天免疫和肿瘤中的作用
4 m6A修饰的circRNA应用及未来发展方向
考虑到circRNA结构的稳定性和保守性，它作为诊断生物标志物和治疗靶点的潜力是毋庸置疑的，近年来越来越多的circRNA相关研究也支持了这一点。然而，表观遗传修饰和circRNA功能之间的关系在很大程度上仍不清楚。作为最丰富的RNA修饰之一，m6A为我们提供了一种中间机制，通过该机制，circRNA被上游分子调节，并使我们能够预测和干扰circRNA失调引起的疾病进展。毫无疑问，这将极大地扩展我们对circRNA的理解并推动其应用。
值得注意的是，在大多数已发现的circRNA中尚未检测到它的特定生物学功能，这也是首次发现的circRNA被视为剪接副产物的原因之一。考虑到带注释的功能性circRNA普遍存在m6A修饰，作者推测它可能与circRNA的组织和发育阶段特异性有关。也就是说，只有在特定组织、发育阶段和亚细胞位置中，特定的circRNA才被特定的分子机制（例如m6A）激活，呈现出差异表达。为了验证这一推测，m6A Hi-Res芯片和RNA-seq的联合分析将有助于进一步研究m6A修饰circRNA的生物学功能和临床应用。
参考文献
[1]：Zhang L, Hou C, Chen C, et al. The role of N6-methyladenosine (m6A) modification in the regulation of circRNAs. Mol Cancer. 2020;19(1):105. Published 2020 Jun 10. doi:10.1186/s12943-020-01224-3