CTC循环肿瘤细胞转录组测序血样如何保存？

导语

CTC在肿瘤精准治疗中的临床应用价值日渐凸显，如何获得高质量的CTC，是临床研究的关键。血液样本离体后会发生溶血、血小板活化等变化，若保存不当，将导致血细胞破碎、细胞形态和表面标志物改变等，不仅影响CTC的分离富集，同时基于CTC的分子和蛋白表达分析也无法开展。研究表明，血样放置2-4h即会出现RNA降解，5h后CTC会丢失60%以上，而12h后约79%的细胞均会发生RNA降解。

目前，临床研究中用于CTC分离的新鲜血样至多只能保存3-4h，使用固定剂可以延长保存时间，如CellSearch的细胞保存液可保存96h。但固定剂会影响细胞活性和RNA稳定性，无法用于后续的CTC基因表达谱分析、体外细胞培养或体内成瘤实验等研究。下面介绍的这种方法或许可以解决您的困扰……

血液样本虽然相对容易获取，但是你以为拿到血样就万事大吉了？NO~NO~~溶血、凝血等现象分分钟毁掉你心爱的样本，好吧，果断弃之；还有更惨的 $C:\Users\ADMINI~1\AppData\Local\Temp\P6Z%{%GD$@EWUZCW]R(H%22.png$ ，色泽、透明度等等都挺正常，但是分离不到CTC，也许是气场跟CTC不合；更惨的有木有？ $C:\Users\Administrator\AppData\Roaming\Tencent\TIM\Temp\G403QXXTJU_WE@2S8VHZZ4V.png$ 有，千辛万苦得到了CTC，提RNA做个转录组吧，RNA你肿么提前阵亡了，呵呵哒 $C:\Users\Administrator\AppData\Roaming\Tencent\TIM\Temp\[`D4X~OEW[KG)$O1_DFY9WW.png$ 老板我又帮您老省了一大笔。此处应有掌声 $C:\Users\Administrator\AppData\Roaming\Tencent\TIM\Temp\WQB(N3}HZFNU9]4(K~U@{_F.png$

福利来了，最近发表于《Nature Communication》的文章探索了一种全新的全血样本保存方法，最长可保存72h，不仅可以保持细胞活性和完整性，还能提到高质量的RNA用于表达谱分析。用上此法，从此告别八百里加急分离CTC的苦恼。 $C:\Users\Administrator\AppData\Roaming\Tencent\TIM\Temp\D[ZDR3A9WZQ{9`1N03KX9$J.png$ 你说的是用固定剂吧，就CellSearch那个，号称可以保存96h呢？我们要做高级版的CTC研究，细胞体外培养、CTC成瘤实验……细胞被弄的半死不活的能行?非也非也，此方法保证纯天然0添加，不含“固定剂”，用了之后啊细胞白白胖胖、活力十足，该成佛成佛，该成瘤成瘤。

什么方法，真有说的那么神？不信出门左拐，别真走啊，听我细细道来。一开始，鬼知道该怎么入手？低温保存错不了，那就4℃低温保存72h，然后将不同类型血细胞的情况都测测呗。

哎呦，不错呦！ $C:\Users\Administrator\AppData\Roaming\Tencent\TIM\Temp\P}RHEDRBRD{LCQYA2_17}8Y.png$ 低温果然没错，长达72h后不同细胞的形态、完整性、活性、表面抗原情况都妥妥的，跟新鲜血样差不多（图1）。

图1 a:中性粒细胞形态；b:白细胞活性和凋亡情况；c:粒细胞活性和凋亡情况及CD11b表达；d:白细胞CD45和CD66b表达；e:红细胞形态；f:棘形红细胞比例

这就完了？能有点技术含量吗？别急，血样低温保存期间常常发生血小板活化，出现血小板聚集和血小板-白细胞粘附等现象，导致堵膜堵孔等各种问题。革命尚未成功，条件仍需优化……

既然血小板聚集，那就用抗血小板凝集试剂，先后尝试了阿司匹林、氯吡格雷和p-selectin抑制剂KF38789，发现处理后并不适用于后续的微流控分离CTC。看来此路不通了~

鉴于之前的血小板功能响应实验中，只有凝血酶刺激下，新鲜或者保存后的全血仍会保留对凝血酶的响应发生凝血，而其他两种激动剂中则会显著降低（图2）。那是不是抗凝剂不够强呢？ $C:\Users\Administrator\AppData\Roaming\Tencent\TIM\Temp\T8OC_M1M[X83ZW@T6}T%C83.png$ 尝试采用GPIIb/IIIa（血小板含量最高的受体，介导凝血中的纤维蛋白结合）抑制剂tirofiban和eptifibatide，结果两种抑制剂都可以完全消除凝血酶诱导的血小板聚集。

图2 a:低温诱导的血小板聚集；b:血小板计数；c:不同激动剂诱导下的血小板聚集；d:图示血小板掩护的白细胞；e&f:流式细胞术检测不同条件下的血小板掩护

然而，新的问题出来了，加入tirofiban可能释放了更多的单一血小板，更容易与血中的白细胞黏附在一起。这种血小板-白细胞黏附作用主要依赖于Ca+，那是不是用二价铁螯合就可以逆转这种结合？结果证明用EDTA孵育15min可有效地释放白细胞黏附的血小板。那加这加那的会不会影响血细胞呢？并不会（图1），细胞活性仍然杠杠的，表面抗原也不会受到影响。

当当当当，新一代血样保存良方新鲜出炉！ $C:\Users\Administrator\AppData\Roaming\Tencent\TIM\Temp\$]S7SX94}JEMONO~A(%)YP2.png$ 就叫它tiro-EDTA低温法吧，具体如何操作？

tiro-EDTA低温法

取ACD抗凝血，加入糖蛋白抑制剂（tirofiban 0.5μg/ml或eptifibatide 50μg/ml），然后4℃静置保存；使用前，加入EDTA 2-5nM孵育15-75min，然后进行后续实验研究。

新的方法是有了，那也不是你说好它就真行了，下面就要真刀真枪地验证了

首先，试试经保存后CTC分离效率如何？

采用时下最火的微流控技术CTC-iChip分离CTC，从细胞回收率、白细胞清除率、红细胞污染情况等方面综合评估，发现血样经tiro-EDTA低温法保存72h后各项参数均与新鲜样本无异（图3）。

图3 CTC-iChip检验全血保存后的CTC分离效率。a:稳定的全血样本是CTC-iChip成功分离CTC的前提。常温保存会导致血液凝集，DNA断裂；不添加tiro-EDTA会导致密集的血小板和细胞凝块；b:不同保存条件下的CTC回收率、白细胞去除率和红细胞残留。

CTC在液体活检里最大的优势是什么？遗传信息完整啊！接下来，作者就验证了CTC中RNA完整性和稳定性。

将LNCaP细胞（一种人源前列腺癌细胞系）掺入健康血液样本中，tiro-EDTA低温法保存48或72h后，回收肿瘤细胞，评估RNA质量（RNA完整性计数RIN）、检测mRNA表达情况（图4）:

RNA质量评估（RIN值）:优
单细胞mRNA表达情况:无明显差异（FN1除外）

图4 RNA质量和分子水平验证

进一步在临床样本中进行验证，同样，RNA完整性和基因表达情况都堪比新鲜血样。

选取结直肠癌患者的血样样本，保存24、48和72h后分离CTC并评估RNA质量，进行CTC转录组分析（图5）:

RNA质量稳定；
40个结直肠癌中高表达基因的表达情况一致（除KRT18外）；
结直肠癌中富有代表性的AR-V7转录本，表达情况高度一致。

图5 结直肠癌患者全血样本验证

至此，经过多重验证，tiro-EDTA低温法是真金不怕火炼，各方面表现优秀。大家可以放心使用了。

$C:\Users\Administrator\Desktop\down_17_12_11_21_19_10.jpg$

此外，这种方法最大的优势在于具有普适性。不管是采用何种CTC分离方法，还是开展何种CTC下游实验，均可以使用上述方法保存血液样本。虽然该优化过程主要针对CTC进行验证，从原理来说应该也可用于其他血细胞的研究，如中性粒细胞转录组分析，该方法更多的应用领域值得进一步探索。

好了，整篇文章差不多讲完了，新的方法get到了吗？欲知更多详情，请看全文。

参考文献：

Wong KHK, Tessier SN, Miyamoto DT, Miller KL, Bookstaver LD, Carey TR, Stannard CJ, Thapar V, Tai EC, Vo KD, Emmons ES, Pleskow HM, Sandlin RD, Sequist LV, Ting DT, Haber DA, Maheswaran S, Stott SL, Toner M. (2017) Whole blood stabilization for the microfluidic isolation and molecular characterization of circulating tumor cells. Nat Commun 8(1):1733.

CTC循环肿瘤细胞转录组测序血样如何保存？

发表评论 取消回复

发表评论取消回复