图片摘要：众所周知，circRNA可以被m6A修饰，本文发现circRNA也能调控总RNA的 m6A修饰。
RNA m6A修饰是近期的热点方向之一，各种RNA都会存在m6A修饰，如mRNA， lncRNA，circRNA，rRNA，miRNA等等。目前已发表的circRNA m6A修饰的文章主要探讨了circRNA的m6A修饰状态和相关的功能机制，circRNA是否参与调控总RNA的 m6A修饰还很少研究。近期，Biological Psychiatry杂志（IF=11.501）发表了一项有趣的工作，发现circSTAG1可以通过结合ALKBH5阻止其入核，影响总RNA的m6A修饰，从另一个角度探讨了circRNA与m6A修饰的关系（[1]）。文章的通讯作者是东南大学的姚红红教授。
作者发现circSTAG1可以结合ALKBH5，抑制其入核，进而改变总RNA的m6A修饰，提高了包括FAAH mRNA等RNA的m6A修饰水平。CUS抑郁症小鼠海马区的circSTAG1表达显著降低，通过ALKBH5改变了FAAH mRNA的m6A修饰，最终导致抑郁症表型（[1]）。
CircSTAG1在严重抑郁症（MDD）小鼠模型和病人标本中低表达
为分析circRNA在MDD中的作用，作者利用高通量测序分析了CUS模型小鼠的海马区的全转录组，分析到了217种显著差异的circRNA分子，其中18种circRNA是人和小鼠高度保守的。经过QPCR检测，circDOCK4-1, circSTAG1, circKALRN 及circDOCK4-2与测序的变化趋势一致，四种circRNA分子在CUS模型中均显著下调。血浆检测结果则显示，这四种circRNA分子中，只有circSTAG1在人和小鼠的血浆标本中有相同的变化趋势，因此选择该分子进行下一步的研究。
circSTAG1由STAG1基因的2-5外显子反向剪切形成。相对于对照组，CUS模型小鼠的海马区，血浆和全血中circSTAG1均明显降低，但STAG1基因的mRNA变化不明显。circSTAG1似乎是脑组织特异性表达的分子，在心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏中表达都很低。MDD患者血清和全血中circSTAG1表达丰度均显著下降，ROC分析的AUC值可达0.763。circSTAG1的表达与评估抑郁症的几种指标均表现出显著的 负相关。
图1 严重抑郁症（MDD）小鼠模型和病人标本中circSTAG1显著降低 （[1]）
过表达circSTAG1可改善抑郁样行为
通过海马区注射过表达circSTAG1的AAV载体，作者分析了circSTAG1在CUS抑郁症模型小鼠体内的作用。结果显示，过表达circSTAG1能够显著改善抑郁症样行为。
图2 体内过表达circSTAG1可改善抑郁症样行为 （[1]）
过表达circSTAG1可缓解CUS模型小鼠海马区星型胶质细胞的功能障碍
基于表面标志物分离CUS模型小鼠海马区的神经元，星型胶质细胞和小胶质细胞，分析了它们的circSTAG1表达状况，结果表明，CUS模型小鼠海马区的星型胶质细胞中circSTAG1显著下降，其他细胞类型的表达略有下降，但变化不显著。FISH原位杂交也证明了这一现象。已知CUS模型小鼠带有神经炎症，会导致星型胶质细胞的功能障碍。于是作者分析了circSTAG1表达与星型胶质细胞功能障碍的关系。GFAP免疫组化分析表明CUS模型小鼠海马区的星型胶质细胞减少，但过表达circSTAG1可明显改善。星型胶质细胞分支水平分析也证明过表达circSTAG1可明显缓解星型胶质细胞的功能障碍。
图3 过表达circSTAG1缓解星型胶质细胞的功能障碍 （[1]）
circSTAG1结合ALKBH5，调控总RNA m6A修饰
已知RNA m6A修饰与抑郁症有关，作者首先分析了CUS模型小鼠海马区总RNA m6A修饰水平，结果表明CUS处理后总RNA m6A修饰显著下降，但过表达circSTAG1可抵消这一变化。过表达circSTAG1并不显著改变m6A修饰的Writer和Eraser蛋白。那么circSTAG1如何改变总RNA的m6A修饰的？是否通过与某种Writer和Eraser蛋白的相互作用实现？于是作者利用RIP实验进行了分析，结果表明，METTL3，METTL14，WTAP及FTO均不能显著富集circSTAG1，但ALKBH5能够显著富集circSTAG1，但不会富集STAG1线性RNA及阴性对照circRNA （作者选了circHECW2）。RNA Pull-down实验也验证了这一现象。CatRAPID 算法可以预测circRNA与蛋白的相互作用位点。经过分析，ALKBH5的345-395aa可能是结合circSTAG1的区域。缺失345-395aa的ALKBH5不再能捕获circSTAG1。circSTAG1位点突变实验也证实了预测的结果。
图4 circSTAG1可以结合ALKBH5（[1]）
CUS处理可改变ALKBH5的定位
CUS处理并不能改变ALKBH5的表达，过表达或干扰circSTAG1也不会改变。ALKBH5的定位是否受到影响呢？分离胞质和核组分后，作者证明了CUS处理后ALKBH5的胞质定位减少，核定位增多。过表达circSTAG1后ALKBH5的胞质定位增多，核定位减少。利用AAV载体在体内干扰ALKBH5也能诱导抑郁样行为。
图5 CUS处理改变ALKBH5定位 （[1]）
CUS处理后ALKBH5介导FAAH mRNA的m6A修饰
meRIP-seq分析表明，CUS处理后很多RNA的m6A修饰发生了变化。修饰位点集中在mRNA的ORF终止密码子和3’UTR区。针对修饰差异显著的基因进行通路分析。在富集分析的结果中，作者找到了FAAH基因，该基因存在两个m6A修饰 Peak，均在3’UTR区。SRAMP分析表明有四个潜在的m6A修饰位点，分别设计QPCR引物，然后分析meRIP后片段化产物丰度，结果显示，四个位点在CUS组均有显著下降。荧光素酶报告基因分析结果表明干扰ALKBH5后野生型序列的RNA会明显被降解，但m6A修饰位点突变后这一变化消失。
图6 CUS处理后ALKBH5介导FAAH mRNA的m6A修饰 （[1]）
circSTAG1通过ALKBH5调控FAAH mRNA的m6A修饰
CUS处理小鼠的海马区FAAH 的mRNA和蛋白的表达均显著升高。星形胶质细胞中干扰ALKBH5后可降低FAAH的mRNA和蛋白水平。干扰circSTAG1后FAAH的mRNA和蛋白水平可以显著增高，但同时干扰ALKBH5，这一变化就抵消了。这表明circSTAG1可以通过ALKBH5调控FAAH的表达。皮质酮处理可显著抑制星形胶质细胞的增殖，但过表达circSTAG1后这一抑制作用被抵消。分别干扰circSTAG1，ALKBH5和FAAH也表明了上述通路在细胞内是存在的。
图7 circSTAG1通过ALKBH5调控FAAH mRNA的m6A修饰 （[1]）
本文为分析circRNA和m6A修饰关系提出了新的角度，circRNA不仅能被m6A修饰，也可以通过结合m6A修饰的酶，实现对m6A修饰过程的调控作用。
参考文献
1. Huang, R., et al., N(6)-Methyladenosine Modification of Fatty Acid Amide Hydrolase Messenger RNA in Circular RNA STAG1-Regulated Astrocyte Dysfunction and Depressive-like Behaviors. Biol Psychiatry, 2020.