杜氏肌营养不良症（DMD）是由DMD基因突变引起的致死性神经肌肉疾病，主要表现为dystrophin缺失、进行性肌肉退化和运动功能丧失。由于多数突变会破坏开放阅读框，外显子跳跃成为绕过移码突变并恢复部分功能性dystrophin表达的重要策略。LEAPER 2.0基于内源性ADAR介导的RNA编辑，通过环状ADAR招募RNA（circ-arRNA）增强RNA稳定性，并靶向关键剪接元件诱导外显子跳跃，为DMD转录后治疗提供了新的技术路径。
近日，北京大学魏文胜教授，昆明理工大学陈永昌教授、季维智院士及上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心王纪文教授团队在Cell发表了题为：“Long-term reversal of Duchenne muscular dystrophy via circular arRNA-guided exon skipping in monkeys and humans ”的研究论文。
该研究基于LEAPER 2.0平台，利用环状ADAR招募RNA（circ-arRNA）靶向DMD转录本的关键剪接元件。该策略通过ADAR依赖性的A→I编辑与ADAR非依赖性的空间阻断双重机制诱导外显子跳跃，从而绕过移码突变并恢复dystrophin表达。研究在非人灵长类模型、患者来源心肌细胞及早期临床探索中均验证了该策略的有效性，提示circ-arRNA介导的外显子跳跃可为DMD及相关遗传病提供新的RNA干预路径。
circ-arRNA的双机制外显子跳跃作用
研究团队构建了靶向剪接受体（SA）位点附近的151 nt circ-arRNA，其环状结构显著提升了RNA稳定性以发挥长效作用。机制上，circ-arRNA通过两种方式协同驱动外显子跳跃：一是招募内源ADAR1介导A→I编辑削弱剪接信号，二是通过空间位阻干扰剪接体对SA及分支点的识别。尽管不同基因对双机制的依赖占比有所差异（如RELA偏向空间阻断，PPIB偏向RNA编辑），但整体而言，该策略的高效外显子跳跃是由ADAR介导的碱基编辑与剪接体空间阻断共同介导完成的。
图1. circ-arRNA通过ADAR依赖性与非依赖性机制促进有效的外显子跳跃
串联circ-arRNA优化提升DMD外显子跳跃效率
为评估circ-arRNA对DMD的外显子跳跃潜力，研究团队基于恒河猴序列设计了circ-arRNA，其编辑效率和范围均高于线性RNA。在此基础上，研究通过调整linker长度构建了2×U6双启动子串联载体（v1–v3）。其中，v3变体的表达水平与SA位点编辑效率最高，成功诱导了约80%的外显子5跳跃。分析表明，外显子跳跃程度与SA位点编辑效率高度相关，而v3的优势机制仍有待进一步阐明。
circ-arRNA诱导DMD外显子跳跃
研究团队基于DMD非人灵长类模型突变背景构建了报告系统。在外显子5跳跃中，靶向野生型序列的circ-arRNA效果优于突变序列设计。在外显子51跳跃中，靶向中部外显子剪接增强子（ESE）效率最高，且跳跃效率随circ-arRNA长度增加而提高，成功恢复了外显子50缺失背景下的开放阅读框。结果表明，优化后的设计实现了有效的外显子跳跃，可用于多种DMD突变类型的校正。
多位点编辑调控外显子跳跃
在DMD外显子5靶点引入A→G突变实验显示，跳跃效率随编辑位点增多而显著提升，完全替换内含子腺苷后效率可达100%。NGS分析证实，该效应源于多位点的累积破坏，通过改变正常剪接信号并激活隐匿位点来实现。此外，研究发现减少配对尿嘧啶以降低旁观者编辑反而会抑制关键位点编辑，进而降低跳跃效率。这一多位点协同编辑机制，赋予了该策略优于ASO（仅依赖空间阻断）及DNA碱基编辑器（编辑窗口受限）的性能优势。
MyoAAV介导的肌肉转导与外显子跳跃
为实现circ-arRNA的体内高效递送，研究团队在恒河猴肌母细胞中对比了多种载体，发现MyoAAV变体的外显子跳跃效率均优于传统AAV9。鉴于MyoAAV 4E兼具高心肌转导效率与低肝脏靶向性（相比AAVrh74），被最终选定用于猴体实验。对野生型恒河猴进行系统给药4周后，其骨骼肌和心肌均成功实现转导并检测到外显子51跳跃信号，其中以心肌组织表现最为显著。
图2. circ-arRNA通过MyoAAV递送在DMD中高效诱导外显子跳跃并实现高效肌肉转导
MyoAAV体内递送circ-arRNA的治疗评估
研究将MyoAAV 4E携带的2×U6-circ-arRNA151-v3系统性注射至两种DMD恒河猴模型。结果显示，exon 5Δ5模型中外显子跳跃在给药后2周出现，8周扩展至多块肌肉，并可持续检测至52周但逐渐下降；exon 5Δ2模型中跳跃效率在4至24周内逐步升高。
两种模型均恢复约10%野生型水平的dystrophin表达，且外显子跳跃效率与circ-arRNA丰度高度相关（R=0.95）。治疗后CK、AST、ALT和LDH水平下降，RNA-seq未发现系统性脱靶剪接事件。结果表明，MyoAAV 4E递送circ-arRNA可在DMD非人灵长类模型中实现外显子跳跃和dystrophin恢复。
早期干预影响DMD功能恢复
非人灵长类DMD模型较啮齿类模型更接近人类神经肌肉生理和行为特征。研究通过1小时自发运动监测和起身测试评估治疗后的运动功能。
在exon 5Δ5模型中，治疗后起身时间缩短，组织学分析显示中心核、坏死和纤维化减少，肌纤维排列改善，相关变化可持续至约1年。相比之下，exon 5Δ2模型虽检测到外显子跳跃和dystrophin恢复，但起身能力改善有限，仅在组织学层面观察到一定改善。这些结果提示，DMD功能恢复受疾病进展阶段影响较大，较早干预可能更有利于获得运动功能获益，也说明非人灵长类模型与临床观察具有一定一致性。
图3. 在两个携带外显子5突变的DMD猴模型中实现高效外显子跳跃及dystrophin恢复
长期功能改善及dystrophin动态变化
exon 5Δ5 DMD猴模型治疗前表现为步行距离和活动水平下降。MyoAAV-circ-arRNA治疗后，动物在34周时运动能力改善，并维持至1年；未治疗DMD猴则继续下降。步态分析显示，治疗1年后步幅增加、足跟接触改善。
分子检测显示，治疗后8周和34周dystrophin恢复并定位于肌纤维膜，但1年时水平有所下降。进一步分析发现，AAV载体拷贝数在52周下降约26%，整体CpG甲基化变化较小，但U6启动子存在部分甲基化。此外，恢复此前缺失的dystrophin区域可能与免疫反应有关。尽管dystrophin恢复水平有限，模型仍维持了约1年的运动功能改善。
图4. Exon 5Δ5模型在治疗后持续的运动功能改善及对dystrophin的免疫原性反应
exon 50Δ7模型中的长期疗效与免疫安全性
研究团队在exon 50Δ7 DMD恒河猴模型中评估MyoAAV 4E递送circ-arRNA的长期效果。给药8周后，QD和TB肌肉中的外显子跳跃效率分别为31%和62%，dystrophin恢复至野生型水平的3.4%和4.7%。1年后未检测到T细胞介导的免疫反应，arRNA表达和dystrophin水平仍可维持，其中TB中dystrophin最高约7%。
治疗后CK、AST、ALT和LDH逐步下降，肌肉组织学表现改善，步行距离、活动水平、步态和起身能力也有所恢复，并维持至1.5年。与exon 5Δ5模型相比，exon 50Δ7模型在1年时表现出更高的dystrophin表达和更好的肌肉功能。
图5. Exon 50Δ7模型中dystrophin的长期恢复及疾病表型的改善
患者来源心肌细胞中的exon 51跳跃与dystrophin恢复
为评估circ-arRNA在人源细胞中的作用，研究使用两名DMD患者来源的iPSC分化心肌细胞，分别携带exon 49–50缺失和exon 52缺失。通过诱导exon 51跳跃，可恢复相应阅读框。
结果显示，AAV递送circ-arRNA可剂量依赖性诱导exon 51跳跃。随着MOI增加，编辑效率和dystrophin表达同步升高；最高可实现约80%的exon 51跳跃，并将dystrophin恢复至健康对照约60%。该结果支持circ-arRNA在人源DMD心肌细胞中的应用潜力。
图6. 在患者来源心肌细胞中有效恢复dystrophin表达
LE051在人类DMD患者中的初步应用
研究团队开发了靶向人DMD exon 51的circ-arRNA疗法LE051，并通过AAV递送诱导exon 51跳跃，预计可覆盖约13%的DMD患者。基于非人灵长类模型结果和早期干预考虑，研究在3名7岁以下DMD患儿中开展同情用药治疗，其中2例接受低剂量，1例接受高剂量。初步人体数据表明，LE051初步显示一定的疗效与总体可接受的安全性，为后续临床评估提供了依据。
LE051在DMD患者中的安全性评估
LE051安全性按照CTCAE标准评估。三例DMD患者均仅出现轻度治疗相关不良事件，包括短暂头痛、恶心、呕吐、腹痛、上呼吸道感染及一过性CK升高等，均自行缓解或经对症处理后改善，未见肝损伤证据。
与既往部分AAV微型dystrophin和PPMO疗法报道的严重不良事件相比，本研究未观察到TR-SAEs或剂量限制性毒性。其较好的耐受性可能与LE051招募内源ADAR、避免表达外源编辑蛋白有关。
LE051的初步临床疗效与功能改善
LE051在三例患者中显示出剂量相关的初步疗效。高剂量组8周时dystrophin恢复至健康对照的2.06%。患者NSAA评分持续改善（两例在随访期内达到满分），运动及心肺功能指标均呈现改善趋势。
生化与动力学方面，患者CK水平最高下降60%~70%，期间的偶发波动未影响功能稳定；肝功能无异常，且给药42天后各项排泄物中的病毒DNA已基本清除。
尽管功能改善超出了DMD自然史预期，但受限于小样本和1年随访，暂无法完全排除发育或主观动机等非治疗因素的影响，仍需更大规模的临床验证。
图7. 通过运动功能及心肺功能改善评估LE051的疗效与耐受性
总结
本研究展示了基于内源性ADAR的circ-arRNA（LEAPER 2.0）策略从非人灵长类模型到人类DMD患者的初步转化。结果表明，MyoAAV递送的circ-arRNA可有效诱导外显子跳跃并恢复dystrophin表达；同时，该策略利用内源性编辑系统避免了外源蛋白的引入，在早期临床中体现出较低的免疫原性风险。
然而，由于目前的人体数据仅来源于三例同情用药的探索性治疗，且随访期仅为一年，尚无法对其长期疗效得出明确结论。未来仍需通过更大规模和更长期的临床试验，进一步评估LE051的长期安全性和有效性。这项研究为DMD的RNA靶向干预提供了重要的概念验证与临床转化依据。
原文链接：
https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(26)00589-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS0092867426005891%3Fshowall%3Dtrue