CAR-T细胞疗法已在血液系统恶性肿瘤治疗中取得重要进展，但传统体外制备型CAR-T仍面临制备流程复杂、周期较长、成本较高和临床可及性受限等问题。体内CAR-T技术通过递送系统将CAR编码基因直接导入患者体内T细胞，使其在体内完成CAR表达和功能获得，从而有望简化治疗流程、提高治疗可及性。与此同时，该类产品涉及基因递送、体内转导、免疫细胞活化及功能调控，其质量控制、体内分布、表达持续性和长期安全性评价仍需进一步研究和规范。
近期，中国食品药品检定研究院王军志院士和梁成罡研究员团队在The Innovation Drug Discovery发表综述文章：“Approaches to in vivo CAR-T therapy technology and considerations of quality control and nonclinical research”。
该综述系统梳理了体内CAR-T疗法中载体与递送载荷的设计策略，总结了近年来的研究进展，并重点分析了其在靶向递送、表达调控、疗效稳定性和安全性方面的持续挑战。在此基础上，团队结合体内CAR-T产品特点，并参考基因治疗及传统CAR-T的技术指导原则，探讨了质量控制和非临床研究中的关键考量，为该类新型治疗技术的临床转化和监管评价提供参考。
体内CAR-T的历史与技术发展
CAR构建设计
CAR-T疗法通过基因工程使T细胞表达CAR，以非MHC依赖方式识别并清除靶细胞。CAR通常由抗原识别域、铰链区、跨膜区和胞内信号域组成，其设计直接影响T细胞活化、持续性和杀伤功能。体内CAR-T多以第二代CAR为基础，但需结合体内递送特点优化共刺激域选择、安全控制模块和靶点切换设计，以提升疗效稳定性和可控性。
图1. 体内CAR-T发展时间线
图2. 嵌合抗原受体（CAR）结构的发展历程
T细胞靶向策略
体内CAR-T递送需将CAR编码基因准确导入目标T细胞。目前常用靶点包括CD3、CD4、CD8和CD7。其中，CD3靶向覆盖T细胞范围较广，但需关注亚群比例和调节性T细胞转导风险；CD8靶向有利于形成细胞毒性CAR-T细胞；CD4靶向主要产生辅助型CAR-T细胞；CD7靶向可同时作用于T细胞和NK细胞，但转导效率仍需优化。常用分子靶向工具包括scFv、纳米抗体VHH和DARPins等，需根据靶点特征和递送平台进行选择。
体内CAR-T递送平台
病毒载体递送平台
病毒载体是体内CAR-T的主要递送方式，包括慢病毒和腺相关病毒（AAV）。慢病毒可实现持久基因表达，但靶向性和静息T细胞转导效率有限，存在非靶细胞转导及抗体中和风险，可通过膜融合蛋白改造和T细胞靶向修饰优化。AAV在基因治疗中成熟，但体内CAR-T应用仍处临床前，受抗体、中和、肝脏趋向性及包装容量限制，可通过衣壳工程和靶向修饰改进。总体需进一步优化靶向性、表达持续性和安全性。
非病毒载体递送平台
非病毒载体是体内CAR-T的重要递送策略，主要包括LNP、阳离子聚合物及肽纳米颗粒、外泌体等新型平台。LNP-mRNA递送效率较高、载荷灵活，适合短期可控表达，也可通过靶向修饰、仿生改造或circRNA延长作用时间。阳离子聚合物可通过化学修饰增强靶向性，但仍面临非特异结合和肝脏清除等问题。其他新型平台在体内CAR-T工程化递送中仍处临床前研究阶段，其疗效、安全性和工艺可控性有待进一步验证。
体内CAR-T临床研发进展
自2022年以来，体内CAR-T研发管线逐步扩展。截至2026年1月初，全球已有90余个候选项目，覆盖血液系统恶性肿瘤、实体瘤和自身免疫性疾病等方向。靶点以CD19及其双靶点组合为主，BCMA、CD20、CD22等B细胞相关抗原次之，GPC3、TROP2等实体瘤靶点也在推进。截至2026年1月底，已有16个候选药物开展研究者发起临床研究，9个产品获得IND批准，主要采用慢病毒载体和LNP-mRNA平台。
图3. 体内CAR-T疗法临床试验适应证及相应CAR靶点
血液瘤体内CAR-T临床进展
体内CAR-T在血液系统恶性肿瘤的研究基于传统体外CAR-T经验，多款产品已进入早期临床，其中CD19和BCMA进展较快。CD19靶向体内CAR-T个案显示，给药后可生成CAR-T细胞并出现有限抗肿瘤反应，主要不良反应为骨髓抑制和低级别细胞因子释放综合征。BCMA靶向体内CAR-T在多发性骨髓瘤中也显示短期扩增和部分缓解迹象，同时存在细胞因子释放综合征及血液学毒性。现有数据样本小、随访短，疗效和安全性仍需进一步验证；CD20等靶点在动物模型中显示潜力。
实体瘤体内CAR-T临床进展
体内CAR相关疗法通过载体在体内重编程免疫细胞，可能增强实体瘤局部免疫。髓系细胞靶向LNP递送抗TROP2 CAR mRNA已进入早期临床，可在肿瘤中检测到CAR阳性髓系细胞，并伴随T细胞募集和肿瘤微环境炎症化，部分患者显示初步抗肿瘤信号。主要不良反应为低级别细胞因子释放综合征、发热和血液学毒性。该疗法仍面临微环境抑制、非靶向转导及疗效持久性不足等挑战。
自身免疫性疾病体内CAR-T临床进展
体内CAR-T在自身免疫性疾病中的应用受到关注，主要因其可清除B细胞、简化治疗流程，并通过重复给药调节治疗强度。抗CD19体内CAR-T已在动物模型及早期临床研究中显示B细胞清除、自身抗体下降、补体改善和疾病活动度降低等信号，主要不良反应为低级别细胞因子释放综合征。tLNP-mRNA平台具有非整合、表达短暂和可重复给药等特点，但疗效持续性和长期安全性仍需进一步验证。
其他疾病中的研究进展
除肿瘤和自身免疫性疾病外，体内CAR-T也在抗纤维化、炎症性衰老、过敏性疾病和感染性疾病等方向开展探索，但整体仍处于临床前阶段。相关研究尝试通过递送抗FAP CAR mRNA清除活化成纤维细胞，以减少胶原沉积并改善组织功能；也有研究利用T细胞靶向LNP递送抗uPAR CAR circRNA清除衰老细胞，减轻肝纤维化损伤。总体来看，这些方向显示出潜在应用价值，但疗效和安全性仍需进一步验证。
体内CAR-T挑战与优化
安全性挑战
脱靶风险
体内CAR-T依赖载体在体内直接递送CAR基因，因此存在非靶向转导风险。若载体进入非免疫细胞，可能因CAR表达导致表位屏蔽，影响治疗性CAR-T识别靶细胞；若转导免疫抑制性细胞，则可能加重免疫抑制并降低疗效。整合型载体还存在插入突变等潜在风险，生产过程中CAR蛋白或靶向配体异常掺入病毒颗粒/包膜也可能增加非靶向转导。为降低风险，可通过局部给药、双靶向载体、微环境响应型设计、组织特异性启动子及TRAP等生产优化策略，提高T细胞选择性并减少潜在毒性。
靶向正常组织风险
除载体脱靶外，CAR-T还可能因正常组织低水平表达靶抗原或设计不完善而误伤正常组织。为降低风险，可采用双特异性或多特异性CAR，使T细胞仅在同时识别多个肿瘤相关抗原时被激活，从而提高靶向特异性并减少抗原逃逸。
基因组随机整合风险
基于慢病毒等整合型载体的体内CAR-T存在随机整合风险。体外CAR-T可通过T细胞筛选降低风险，而体内递送可能脱靶至干细胞等长寿命细胞，因此需关注整合位点和潜在插入突变。核心策略是位点特异性整合：通过共同递送CAR基因模板和瞬时表达的基因编辑系统（如CRISPR-Cas9或转座酶），将CAR精准插入AAVS1等安全位点，以降低插入突变和基因毒性。
功效挑战
体内转导/转染效率低
体内CAR-T生成效率普遍偏低，多平台和动物模型中，CAR阳性T细胞仅为个位数至低双位数。这受组织屏障、载体被抗体清除、静息T细胞难以转导及内涵体逃逸不足等因素限制。提升效率可通过三方面优化策略：载体设计（如LNP优化脂质成分、病毒载体衣壳改造减少清除）、载荷优化（如环状RNA延长半衰期、增加细胞接触时间）、给药策略（局部或重复给药累积转导）。
T细胞异质性、耗竭与活化不足
患者T细胞高度异质且常功能耗竭，限制体内CAR-T疗效。初始态/中心记忆T细胞增殖持久性较佳，γδ T和NKT细胞有利肿瘤浸润。体内递送载体靶向精度有限，转导群体多样且可能加剧耗竭。可通过靶向高增殖亚群、联合免疫检查点抑制剂、扩展至CAR-NK或CAR-巨噬细胞、载体共刺激或免疫调节因子、局部递送改善微环境，提升CAR-T活性和疗效。
其他挑战
体内CAR-T剂量-反应复杂且难预测，因给药的是载体而非成品细胞，其药代动力学和转导效率受个体遗传、免疫状态及疾病阶段影响，且无法精确控制CAR表达、细胞活力和亚群组成。可通过短暂表达系统（如LNP-mRNA）、安全开关或可调控CAR表达、可切换/ split-CAR平台降低风险并提高靶点灵活性。疗效可通过联合治疗、T细胞预激活（如IL-7）或设计药物响应元件增强T细胞活性。
体内CAR-T疗法的质量控制要点
体内CAR-T的最终产品是载有CAR基因的递送载体，其质量控制重点在于核酸和载体本身，包括体内分布、靶向特异性、转导效率、生产工艺、放行标准及稳定性。作为基因治疗产品，其质量管理可遵循ICH Q9/Q10等指南，并结合基因治疗和CAR-T药物相关规范。慢病毒载体与LNP平台机制不同，因此关键质量属性和控制重点也有所差异。
图4. 基于LNP与慢病毒的体内CAR-T疗法生产与质量控制流程比较
慢病毒体内CAR-T质量控制要点
生产材料控制
慢病毒载体起始材料包括质粒、生产细胞、培养基、添加剂及赋形剂等，相关控制标准可参照ICH Q5D及病毒载体相关指南制定。
工艺参数、过程控制与验证
慢病毒载体生产流程复杂，需控制关键工艺参数并监测细胞活率、载体滴度、感染活性、纯度、残留杂质及包膜特征等质量属性，以保证批间一致性和安全性。作为体内给药的基因治疗产品，应更重视物理滴度或载体颗粒数等剂量控制指标。工艺验证需覆盖连续批次、关键参数范围、清洁验证和分析方法验证，确保产品稳定符合质量标准。
产品特性分析
慢病毒体内CAR-T需从基因组、蛋白质和病毒颗粒层面表征结构与功能，重点控制活性、纯度、杂质和安全性，保证批间一致性和放行质量。由于载体直接体内给药，应验证假型包膜、scFv或DARPin等靶向修饰的稳定性和CD3/CD8结合活性，并控制HCP/HCD残留、聚集体、游离蛋白及异常掺入病毒颗粒等杂质。安全性方面需关注随机整合、插入突变和脱靶转导风险。生物活性可通过CAR阳性率、细胞因子释放、杀伤实验和T细胞特异性转导效率进行评价。
质量标准建立
体内CAR-T质量标准主要用于产品放行和稳定性研究。慢病毒载体需重点控制包膜与核酸鉴定、病毒聚集体、复制型慢病毒、非感染性颗粒比例及残留DNA等，并通过CAR阳性率、目标基因表达和杀伤活性评价效力。LNP-mRNA平台则侧重颗粒均一性、脂质组成和mRNA完整性，包括粒径、包封率、多分散性、脂质比例、帽子化效率、poly(A)尾长度和纯度等；靶向LNP还需评价表面靶向分子。
tLNP体内CAR-T质量控制要点
生产材料控制
靶向LNP（tLNP）材料组成更复杂，需重点控制mRNA、脂质和靶向组分，以保证质量一致性。mRNA应关注模板、序列、纯度、完整性、帽子化效率、poly(A)尾长度、修饰核苷酸、无菌和内毒素等指标。脂质需明确结构和合成路线，并控制纯度、残留溶剂及可电离脂质pKa等功能特性。靶向抗体需控制纯度、聚集体、含量和结合活性；若涉及片段化或偶联，中间体也需相应控制。
工艺参数、过程控制与验证
tLNP生产需遵循相关工艺控制要求，并重点监测抗体偶联率、游离抗体残留等关键指标。工艺验证应通过连续批次证明产品稳定符合CQA，同时完成清洁验证、分析方法验证及偶联工艺专项验证。
产品特性分析
LNP-mRNA载体质量取决于化学组成和纳米结构稳定性，关键指标包括脂质比例、靶向分子偶联率、mRNA完整性、帽子化效率、poly(A)尾长度、粒径、PDI和包封效率等。这些属性直接影响体内分布、靶向性和T细胞转染效率，临床放行需重点关注活性、纯度和杂质控制。
LNP-mRNA质量标准建立
LNP-mRNA产品需建立覆盖原材料、原液和成品的质量标准，并明确检测方法、验收标准和验证要求。靶向LNP应重点控制抗体偶联率、游离抗体残留及结合活性。质量检测可借鉴已获批LNP-mRNA疫苗，并结合体内CAR-T机制，重点评估组分鉴定、mRNA完整性、杂质残留、靶基因表达、生物活性、体外CAR阳性率，以及包封率、粒径、pH、内毒素和无菌等指标。稳定性研究应关注mRNA完整性、CAR表达效力及抗体偶联/结合活性变化。
体内CAR-T疗法非临床研究要点
体内CAR-T非临床研究旨在明确作用机制、有效剂量和潜在毒性，为早期临床试验的受试者选择、给药方案、疗效评价和风险监测提供依据。其兼具基因治疗和细胞治疗特征，需重点评估原位生成CAR-T带来的脱靶毒性、随机整合、免疫原性和潜在成瘤风险。不同平台在整合风险、靶向性、免疫原性和表达持续时间上存在差异，动物模型、安全性终点和药代研究设计应结合产品特点制定。
供试品与动物选择
试品与给药途径
非临床供试品应代表临床候选产品，并在生产工艺、关键质量属性和放行标准上保持一致。因CAR分子存在物种特异性，动物实验可使用动物源替代CAR，但需说明代表性依据，并尽量保持生产和质控一致。动物给药途径应尽量与临床一致；对于LNP-mRNA等重复给药产品，还需确保给药周期内制剂质量稳定。
动物模型选择
非临床研究应选择能反映载体分布、转导效率、CAR表达和药理活性的动物模型，常用人源化小鼠和非人灵长类（NHP）。慢病毒载体可用人源化小鼠评估CAR-T生成和靶向性，必要时采用交叉反应性替代物在NHP中评估长期整合安全性和免疫原性。LNP-mRNA平台则需重点关注重复给药、免疫毒性和CRS相关风险。模型选择应结合研究目的和平台特点综合确定。
药效学研究
体外药效学研究
体外药效学研究可采用人PBMC或原代T细胞，评估转导/转染效率、CAR表达持续性、T细胞活化及靶细胞杀伤能力。因CAR-T活性受抗原密度影响，建议使用不同抗原表达水平的靶细胞进行评价。若含细胞因子诱导结构域、安全开关或药物诱导元件，应进行功能验证并评估相关联合用药。类器官模型可补充实体瘤药效评价，但尚不能替代动物模型。
体内药效学研究
体内药效学研究重点评估CAR-T在体内的生成、扩增、持续时间和功能活性。肿瘤适应症可采用人免疫系统重建并接种肿瘤的小鼠模型，验证原位CAR-T生成及抗肿瘤作用；自身免疫性疾病可采用人造血干细胞重建小鼠，评估CAR-T生成和B细胞清除能力。
具备交叉反应性替代制剂时，可进一步使用犬或NHP等大动物模型验证药效和机制。不同平台给药特征不同：慢病毒载体作用可能更持久，LNP-mRNA表达短暂，通常需重复给药，相关结果可为临床给药方案提供依据。
药代动力学研究
体内分布研究
体内分布研究用于评估载体及体内生成CAR-T细胞在给药部位、靶器官、目标细胞和非靶组织中的分布、滞留与清除，可单独开展或结合药效/毒理研究进行。检测方法可包括qPCR/ddPCR、qRT-PCR、原位杂交或免疫组化等，以明确CAR转基因及其表达细胞类型。整合型载体需重点关注性腺、骨髓造血干细胞等长寿命细胞中的分布和整合风险；LNP-mRNA等非整合型载体则应关注肝脏等非靶组织富集及新组分的清除动力学。
载体排泄与脱落研究
载体排泄/脱落研究用于评估基因治疗产品经排泄物或分泌物排出体外的情况。尽管体内CAR-T多采用复制缺陷载体，仍需根据产品特点开展评估。例如，UB-VV111给药后未在小鼠排泄物或分泌物中检测到载体基因组。对于新型T细胞靶向抗体偶联LNP，还应通过组织交叉反应试验和膜蛋白芯片筛查，评估潜在非特异性结合风险。
安全性评价
安全药理评价
安全药理研究用于评估体内CAR-T对中枢神经、心血管和呼吸等重要功能的影响，通常可与毒理或药代研究合并开展。由于神经毒性可能与免疫激活和CRS相关，应优先选择可反映CRS风险的动物模型；相关tLNP制剂在食蟹猴静脉给药后未见中枢神经系统相关不良表现。
一般毒理评价
体内CAR-T一般毒理研究通常在人源化小鼠或NHP中开展，并采用临床相关给药方案。评价指标包括体重、临床观察、临床病理、免疫表型、CAR-T生成、免疫毒性和组织病理学检查，恢复期应根据药效持续时间和毒性可逆性设置。
免疫原性和免疫毒性是重点关注内容。慢病毒载体需关注既有抗体影响，LNP平台需评估脂质、PEG化脂质和mRNA相关免疫反应，尤其是CRS风险。重复给药的LNP-mRNA产品还应评估免疫耐受性和累积毒性。
生殖与发育毒性评价
体内CAR-T的生殖与发育毒性应结合产品特性、作用机制、适应症、人群范围、一般毒理和体内分布结果综合评估，并参考基因治疗相关指南。若提示生殖器官毒性，应进一步开展生育力和早期胚胎发育研究。重点关注载体是否在性腺持续存在、是否暴露于生殖细胞及胚系传播风险。整合型载体需关注胚系整合风险；LNP-mRNA等非整合型载体则应关注生殖器官分布及相关生殖/发育毒性。
遗传毒性与致瘤性评价
体内CAR-T可能转导干细胞或非靶细胞，因此需重点关注整合相关遗传毒性和致瘤风险。慢病毒载体应评估非特异性转导、载体拷贝数、整合位点分布及插入突变风险。LNP-mRNA平台因短暂、非整合表达，通常无需整合位点分析；但采用转座或基因编辑系统的平台，需评估转座足迹、脱靶编辑及相关遗传毒性风险。
制剂安全性评价
制剂安全性应按照拟定临床给药途径进行评价。对于静脉给药产品，可在一般毒理研究中同步观察局部耐受性，并开展体外溶血试验，以评估血液相容性和给药安全性。
总结与展望
本文梳理了体内CAR-T的递送平台、应用进展、设计优化、质量控制和非临床评价要点。体内CAR-T可在患者体内原位生成CAR-T细胞，有望简化制备流程、降低成本并提高治疗可及性。目前，该技术已在肿瘤和自身免疫性疾病等领域显示出初步潜力，但仍面临靶向性不足、脱靶风险、剂量可控性有限和长期安全性不明确等挑战。
未来需进一步优化递送系统，提高转导效率和靶向精度，降低整合、免疫原性和非靶向递送风险，并通过完善规模化生产、质量控制、非临床评价和监管路径，推动体内CAR-T从技术概念走向更可控、更可及的临床应用。
此外，作为突破现有技术瓶颈的探索方向之一，circRNA等新型核酸载荷展现出特定的研发优势。得益于其闭环结构带来的高核酸酶抗性与长半衰期，且无基因组整合风险，基于LNP等递送系统的circRNA-CAR技术有望在规避基因毒性的同时延长靶基因的表达时间，或将成为下一代体内细胞疗法的重要研究方向。
原文链接：
https://www.the-innovation.org/article/doi/10.59717/j.xinn-drugdisc.2026.100012