CRISPR-Cas12a系统在分子诊断与基因编辑中具有重要应用潜力，但仍面临“检测依赖预扩增”与“编辑缺乏时空控制”的双重挑战。前者增加了操作复杂性及气溶胶污染风险，后者则提高了非靶细胞或非目标位点发生脱靶编辑的可能性。因此，开发一种兼具免扩增检测与条件性基因编辑能力的一体化系统，已成为CRISPR技术工程化改造中的重要研究方向。
近日，陆军军医大学西南医院张军教授、陈鸣教授、Huiyou Chen联合四川大学团队，在国际学术期刊Advanced Science发表研究论文：TopCas: Topology-Gated Cas12a via DNA-RNA Chimeric Circular crRNA for Amplification-Free Nucleic Acid Detection and Conditional Gene Editing。
该研究创新性地构建了一种基于DNA-RNA嵌合环状crRNA（CcrRNA）的拓扑门控Cas12a系统（TopCas）。该系统通过CcrRNA的拓扑结构约束抑制Cas12a非特异性活性，并借助靶标触发的自催化级联反应实现免扩增核酸检测。更重要的是，TopCas系统可作为条件激活开关，仅在特定疾病标志物存在时启动基因组编辑。该双功能平台为分子诊断与时空可控的基因干预提供了新的技术路径。
TopCas平台的设计
TopCas平台利用DNA-RNA嵌合环状crRNA的拓扑结构约束效应抑制Cas12a的非特异性活性。靶标核酸激活初始复合物后，可切断CcrRNA中的DNA连接段，使其线性化并恢复活性，进而引发自催化级联反应。激活后的Cas12a既可用于核酸检测，也可介导靶向基因编辑。
图1｜DNA-RNA嵌合环状crRNA介导的CRISPR-Cas12a平台（TopCas）示意图。其中，TcrRNA表示靶标激活型线性crRNA。
CcrRNA的制备与优化
CcrRNA的构建是TopCas平台实现拓扑门控的基础。研究团队根据Cas12a复合物的结构特征设计了DNA连接段长度，并采用CircLigase介导环化，结合外切酶去除线性杂质，以获得高纯度单体环状crRNA。同时，研究还优化了连接段长度、连接位点序列及产物稳定性等参数，为TopCas平台的建立提供了基础。
图2｜利用 CircLigase 制备环状核酸。
Cas12a反式切割活性的拓扑调控
由于单一环状crRNA对Cas12a活化的约束作用有限，且线性底物易被外切酶降解并引发非特异性激活，研究团队进一步引入了环状DNA底物。结果表明，单独依赖底物拓扑调控的效果较为有限，而环状底物与环状crRNA联合使用可更有效地抑制Cas12a非特异性活性，并降低crRNA与Cas12a的结合能力。进一步分析提示，两种互补的环状核酸可形成更复杂的拓扑结构，这是TopCas实现非特异性活性抑制和靶标触发激活的重要基础。
图3｜不同DNA底物和crRNA对Cas12a反式切割激活效果的比较。
TopCas平台的建立与验证
为提高Cas12a激活的可控性，研究团队将经硫代磷酸酯修饰的环状DNA底物与CcrRNA结合使用。研究进一步分析了Cas12a对DNA连接段的切割偏好，确定了维持活性的最小线性crRNA长度，并通过特定位点修饰降低了背景激活。体外实验表明，靶标可触发CcrRNA线性化并引发后续级联切割，从而产生可检测的荧光信号。研究还发现，RNA靶标同样可以激活该系统，但效率低于DNA。以上结果共同确立了TopCas平台的基本工作框架。
图4｜由嵌合环状crRNA介导并通过拓扑变化激活的TopCas分子诊断平台，可诱导Cas12a反式切割活性。
TopCas平台的优化及分子检测性能评估
为提高TopCas系统性能，研究团队对关键参数进行了优化。结果表明，10nt DNA连接段在信号输出与背景控制之间较为平衡；环状DNA底物PAM区经硫代磷酸酯修饰后，稳定性进一步提高。温度升高可增强荧光信号，但也会增加背景噪声。在组分比例上，TcrRNA与CcrRNA的最佳比例为1:10至1:30，CcrRNA与报告底物的最佳比例为1:1。此外，常规游离荧光报告分子更适合常规应用。上述优化为TopCas系统在核酸检测和基因编辑中的应用提供了实验依据。
在检测性能方面，TopCas在化学合成靶标和细胞核酸提取物中均表现出较好的特异性，与qPCR/RT-qPCR结果基本一致；在无预扩增条件下，对DNA靶标的检测下限可达100 aM，而RNA靶标所需浓度相对更高。结果表明，TopCas具备免扩增条件下低丰度核酸检测的应用基础。
图5｜TopCas系统的优化、特异性与灵敏度分析。
TopCas的检测应用
为评估TopCas的应用性能，研究团队对HPV16和SARS-CoV-2临床样本进行了检测，结果与qPCR/RT-qPCR基本一致。其中，DNA靶标的阳性和阴性符合率均为100%，RNA靶标的阳性符合率为100%，阴性符合率为95%。进一步实验表明，TopCas还可用于HuH-7细胞内HBV靶标的原位检测，且荧光信号强度与靶标浓度相关。上述结果说明，TopCas具有临床样本检测和细胞内靶标分析的应用基础。
图6｜TopCas系统用于临床样本检测及细胞内靶分子分析。
TopCas的条件性基因编辑
基于TopCas的拓扑门控机制，研究团队构建了由特定核酸标志物触发的条件性基因编辑系统。该系统采用编辑型嵌合环状crRNA（E-CcrRNA），在初始状态下抑制Cas12a活性；当胞内存在特定靶标时，E-CcrRNA被切断并线性化，随后与Cas12a组装并介导靶向编辑。体外实验表明，该过程具有明确的靶标依赖性，并支持多位点编辑。细胞实验进一步显示，在HBV序列触发条件下，TopCas可介导EGFP基因编辑并降低其表达。尽管其编辑效率低于传统Cas系统，但为条件性基因编辑提供了新的实现方式。
图7｜TopCas系统介导的条件性基因编辑。
总结
本研究构建了基于DNA-RNA嵌合环状crRNA的拓扑门控Cas12a平台TopCas，实现了无需预扩增的核酸检测和依赖特定标志物触发的条件性基因编辑。该系统在降低检测背景信号和提高编辑可控性方面显示出应用潜力，也为分子诊断与可控基因编辑的一体化设计提供了新的思路。
原文链接：
https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.75046