细胞外囊泡（EV）具有天然的低免疫原性、良好的生物相容性以及跨越生物屏障的能力，是核酸药物递送的重要载体。同时，环状RNA（circRNA）因结构稳定且能持久翻译蛋白，在新型核酸疗法的开发中备受关注。不过，当前基于EV的circRNA递送仍面临两方面难题：一方面circRNA在供体细胞内的环化和表达效率有限；另一方面，缺乏有效的主动分选机制，使其装载进入EV的效率较低。这些因素共同限制了circRNA的递送效率和后续蛋白表达水平，也影响了其进一步转化应用。
近日，南方医科大学第十附属医院李振华团队在bioRxiv发表研究论文：“Extracellular Vesicles Enable CircRNA Delivery via in situ Biogenesis and Sorting”。
该研究开发了一种基于EV的circRNA递送平台，通过整合原位生成、Snu13介导的主动分选以及囊泡生成增强策略，在不影响囊泡完整性的前提下，实现了circRNA的高效装载与持久表达。基于这一平台，研究团队不仅构建了靶向树突状细胞的circRNA肿瘤疫苗，诱导出显著的抗原特异性免疫反应，还证实递送编码BNP的circRNA可有效减轻阿霉素诱导的心肌纤维化，显示出其在肿瘤免疫和蛋白替代治疗中的应用潜力。
图 1.circRNA表达载体构建及EV装载示意图
circRNA表达载体优化
在载体设计层面，研究团队利用Twister核糖酶与RtcB连接酶介导原位环化，构建了高度优化的circRNA表达系统。通过引入1686bp spacer，circRNA转录水平显著提升约3000倍；协同应用 HRV-B3 IRES、WPRE及LTR元件后，蛋白翻译效率提高至约3倍。RT-PCR与RNase R消化实验证实了其完整的环状结构与极高的生物稳定性。该高效表达系统的构建，为后续实现EV高效递送提供了核心支撑。
图 2. 优化的细胞内circRNA表达载体的构建与表征
EV递送circRNA平台的构建与表征
研究团队开发了工程化EV平台，通过CD63-Snu13 与C/D Box的特异性识别实现circRNA主动富集，并利用STEAP3、SDC4和NadB协同提升EV产量。细胞实验证实，仅在各组分共表达时方可检测到目标蛋白的显著表达，验证了递送系统的有效性。表征结果显示，EV呈均一球形，直径约110.5 nm，Western blot确认了标志物及融合蛋白的完整性。经优化，每109个EV内circRNA拷贝数由5×104提升至3×107。此外，EV封装显著增强了circRNA的抗降解能力，为实现长效核酸治疗提供了工程学基础。
图 3. circRNA装载细胞外囊泡的构建与表征
EV-circRNA疫苗诱导强效免疫应答
基于该平台构建的靶向疫苗（circRNAOVA-DCpep@EVs），通过CD63-Snu13实现了circRNA 的主动富集，并利用DCpep表面修饰显著提升了树突状细胞的摄取效率。实验证实，该疫苗可诱导 BMDC成熟并促进促炎因子分泌。体内研究表明，疫苗能优先靶向淋巴结DC，使抗原蛋白持续表达超 7 天，进而扩增抗原特异性CD8+ T细胞，实现对B16-OVA细胞的有效杀伤，展现出强效的功能性免疫应答。
图 4. 基于EV的circRNA疫苗诱导的免疫反应
EV-circRNA疫苗诱导抗肿瘤免疫
在B16-OVA小鼠模型中，circRNAOVA-DCpep@EVs疫苗表现出显著的抑瘤效应，不仅有效扩增了脾脏抗原特异性CD8+ T细胞，还诱导了中央及效应记忆T细胞的产生。治疗实验证实，该疫苗显著延长了荷瘤小鼠的生存期，且安全性良好。肿瘤微环境（TME）分析显示，CD3+和 CD8+ T细胞浸润增强，抗原特异性CTL比例升高，H&E 染色观察到大面积肿瘤组织坏死。上述结果证明，该EV疫苗通过系统性免疫激活与局部微环境重塑，诱导了强效抗肿瘤应答，其中DCpep修饰在增强DC摄取与抗原呈递中发挥了关键作用。
图 5. EV递送circRNA疫苗在B16-OVA小鼠黑色素瘤模型中的预防性和治疗性效果
EV-circRNA递送BNP缓解心肌损伤
利用工程化EV平台递送编码人BNP的circRNA（circRNABNP@EVs），在阿霉素（DOX）诱导的小鼠心脏毒性模型中实现了约一周的持续BNP表达。治疗后，小鼠循环NT-proBNP水平显著降低，心脏射血分数、缩短分数及心输出量等功能指标均得到明显改善。组织学分析证实，EV-circRNA治疗有效减轻了心肌纤维化，增加了心肌细胞横截面积，并减少了TUNEL阳性凋亡细胞，表明其显著缓解了阿霉素引起的心肌损伤与结构重塑。
图 6. 系统给药BNP缓解小鼠阿霉素诱导的心脏毒性
总结
本研究构建了一个高度模块化、可编程的EV递送平台，解决了circRNA递送中装载难、表达短两大瓶颈。通过原位生成与主动分选机制，该平台在肿瘤免疫（OVA疫苗）与非肿瘤疾病（BNP蛋白替代治疗）中均表现出显著的治疗效果。这项工作不仅为 circRNA的高效递送提供了新方案，也为工程化EV核酸药物的研发与转化提供了有效参考。
原文链接：
https://www.biorxiv.org/content/10.64898/2026.04.24.720573v1