肿瘤新抗原疫苗在个性化免疫治疗中具有较大潜力，但传统线性mRNA疫苗存在体内稳定性不足、半衰期较短和冷链依赖较强等问题，限制了其临床应用。相比之下，circRNA因具有共价闭环结构，稳定性较高、耐受外切酶降解能力较强，并有望实现更持久的抗原表达。以黑色素瘤为例，这类肿瘤易发生免疫逃逸，而PD-1抗体等免疫检查点阻断剂单药治疗响应有限，线性mRNA疫苗也难以提供持续的抗原刺激。因此，开发以circRNA为代表的新型核酸疫苗平台，正成为肿瘤免疫治疗研究关注的方向。
近日，中南大学湘雅基础医学院熊炜研究员团队在 Cancer Letters 上发表最新研究：A circRNA Neoantigen Vaccine Elicits Potent Antitumor Immunity and Synergizes with Checkpoint Blockade in Melanoma。
该研究开发了一种编码多种黑色素瘤新抗原的circRNA疫苗，并在小鼠模型中验证了其抗肿瘤作用。结果显示，该疫苗可抑制肿瘤生长、增强抗肿瘤免疫反应，并对肿瘤及免疫微环境产生影响。进一步研究发现，该疫苗与抗TIGIT/PD-1阻断联用可获得更好的抗肿瘤效果，提示基于新抗原的circRNA疫苗在黑色素瘤治疗中具有应用潜力，并为个体化RNA疫苗及联合免疫治疗策略优化提供了实验依据。
circRNA新抗原疫苗的构建
研究团队在小鼠黑色素瘤细胞系B16F10中筛选出5个突变表位，并据此构建了编码多种新抗原的circRNA疫苗circRNA-MNA，同时构建了编码单个新抗原的circRNA-SNA。经多种方法验证，所构建的circRNA产物环化准确，具有较好的稳定性，并可在细胞中表达相应新抗原。在RNase R消化验证中，circRNA表现出良好的抗降解能力，相关实验采用吉赛生物RNase R试剂（货号：R0301）。随后，研究人员将circRNA疫苗包封于脂质纳米颗粒中进行递送。结果显示，该递送体系包封效率较高，粒径较为均一，能够实现细胞内递送和新抗原表达，且未见明显细胞毒性。
图1. 靶向B16F10的circRNA新抗原疫苗构建及LNP-circRNAMNA复合物表征
circRNAMNA疫苗抑制肿瘤生长
研究评估了circRNA疫苗的免疫原性及抗肿瘤作用。结果显示，circRNAMNA和circRNASNA均可诱导先天免疫激活和新抗原特异性T细胞应答，其中多表位circRNAMNA的免疫效果更明显，且未见明显系统毒性。在预防性和治疗性黑色素瘤小鼠模型中，两种疫苗均可抑制肿瘤生长，其中circRNAMNA作用更为突出。进一步分析发现，疫苗接种后CD4⁺和CD8⁺T细胞应答增强，肿瘤组织中T细胞浸润增加，调节性T细胞比例下降。T细胞清除实验表明，疫苗的抗肿瘤作用依赖T细胞介导。
图2. 新抗原circRNA疫苗在预防性和治疗性小鼠模型中均显著抑制肿瘤生长
单细胞解析肿瘤微环境变化
为分析circRNAMNA疫苗的作用机制，研究团队对接种疫苗后的小鼠黑色素瘤组织进行了单细胞转录组测序。结果显示，疫苗处理后肿瘤微环境的细胞组成发生变化，主要涉及黑色素瘤细胞、单核/巨噬细胞和T细胞等群体。
进一步分析发现，黑色素瘤细胞可分为Ccl6⁺Mel、Cdk1⁺Mel和Cdhr4⁺Mel三个亚群，其中Ccl6⁺Mel亚群在疫苗接种后明显减少。该亚群与趋化因子信号、白细胞募集、抗原加工与呈递等过程相关；而Cdk1⁺Mel和Cdhr4⁺Mel亚群则更多表现出细胞增殖、代谢和迁移相关特征，免疫相关通路活性相对较低。这些结果提示，不同肿瘤细胞亚群对疫苗的应答存在差异。
图3. 单细胞水平的黑色素瘤细胞转录组图谱
疫苗重塑肿瘤内单核/巨噬细胞组成
研究发现，circRNAMNA疫苗接种后，肿瘤内单核/巨噬细胞浸润增加，其细胞组成也发生变化。与对照组相比，具有抗肿瘤特征的Mono-Vcan、Macro-C1qc和Macro-Ifng亚群比例上升，而与免疫抑制相关的Macro-Spp1亚群减少。
进一步分析显示，疫苗组肿瘤微环境中的细胞间通讯增强，Ccl6⁺Mel亚群与单核/巨噬细胞之间的趋化因子信号更为活跃。轨迹分析还表明，疫苗接种后，单核细胞更倾向于向具有抗原呈递和干扰素活化特征的巨噬细胞分化。整体来看，circRNAMNA疫苗可影响肿瘤内单核/巨噬细胞的组成和分化状态。
图4. 单核/巨噬细胞不同亚群的功能特征与演化轨迹
疫苗增强T/NK细胞抗肿瘤应答
研究团队进一步分析了疫苗接种后T细胞和NK细胞的变化。结果显示，circRNAMNA接种后，初始T细胞比例下降，TCR克隆多样性增加，CD4⁺效应T细胞比例上升，CD8⁺细胞毒性T细胞克隆扩增增强，提示疫苗促进了抗原特异性T细胞活化和效应分化。
同时，疫苗组NK细胞浸润增加，单核/巨噬细胞与T/NK细胞之间与抗原呈递和细胞迁移相关的信号增强。研究还发现，疫苗接种后CD8⁺耗竭T细胞比例升高，其中TIGIT表达较高，提示circRNAMNA与TIGIT相关免疫检查点阻断联用具有进一步研究价值。
图5. T/NK细胞单细胞聚类图谱
检查点阻断增强疫苗疗效
研究团队进一步评估了circRNAMNA疫苗与免疫检查点阻断联用的效果。结果显示，与疫苗单用相比，联合抗TIGIT或联合抗TIGIT/抗PD-1可进一步增强抑瘤作用，其中三联方案效果最明显。进一步分析发现，联合治疗可增强肿瘤浸润CD4⁺和CD8⁺T细胞功能，并提高IFN-γ和TNF-α水平，且未见明显毒性。
图6. circRNAMNA疫苗联合免疫检查点治疗在小鼠中协同抑制肿瘤生长
总结
本研究利用LNP递送平台构建了针对黑色素瘤新抗原的circRNA疫苗，并验证了其在体内稳定性和免疫应答持续性方面的表现。结合单细胞多组学分析，研究进一步揭示了疫苗作用后的肿瘤微环境变化，为个体化肿瘤核酸疫苗的开发提供了参考。
在此基础上，肿瘤新抗原疫苗的进一步研究仍有赖于抗原表达、递送效率和微环境调控等方面的持续优化。通过单细胞测序识别潜在治疗靶点，如TIGIT，本研究也为circRNA疫苗联合免疫检查点阻断策略及其后续研究提供了依据。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0304383526002223