功能性RNA往往具有特定的亚细胞定位特征，但环状RNA（circRNA）由于与线性mRNA序列高度重叠，其空间定位研究长期受限。现有检测手段如Northern blot、qPCR等无法提供单细胞分辨率的空间信息；而原位杂交（ISH）技术又因探针容易与线性转录本产生交叉杂交，导致特异性不足。早期的smFISH方法受制于circRNA片段较短、探针数量不够及复杂的图像处理流程；基于HCR的ampFISH则容易产生高背景噪声，影响结果可靠性。因此，亟需一种具备高特异性、单分子分辨率的circRNA成像技术，以精准解析circRNA的亚细胞定位、细胞类型异质性及其潜在功能机制。
近期，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心的陈玲玲团队在bioRxiv发表研究论文：abcFISH enables multiplexed, single-molecule visualization of circular RNA spatial heterogeneity。
该研究建立了基于扩增子的环状RNA荧光原位杂交技术（abcFISH）。该方法通过优化滚环扩增（RCA）策略精准靶向circRNA的反向剪接连接（BSJ）位点，实现了对circRNA的高特异性、单分子水平成像。abcFISH能在细胞与组织中进行定量、多重检测，不仅揭示了单个基因座的可变环化模式、细胞类型特异的circRNA表达特征以及神经元与脑组织中的空间分布，还首次可视化了Cdr1as与Cyrano的共定位及其功能互作。此外，该技术也被用于验证治疗性双链circRNA适配体的有效性，展现出重要的应用潜力。
RCA-abcFISH实现高特异性的circRNA单分子检测
依托在BSJ周围精准设计的padlock/primer探针，abcFISH通过RCA仅在BSJ±5nt区域产生特异信号，偏离则信号明显下降，体现严格序列特异性。相比易漏检或背景高的smFISH与circFISH，abcFISH在信噪比与检测准确性上更具优势，是更可靠的circRNA空间成像与定量工具。
图1 RCA机制实现circRNA的单分子成像
abcFISH显著优于现有circRNA成像方法
相比smFISH与ampFISH，abcFISH具有更高的特异性、更低的背景噪声以及最佳信噪比，能避免ampFISH易产生的非特异放大与假阳性信号；同时无需多探针、几乎不受转录本长度限制，并依托统一的padlock骨架和BSJ精准靶向，实现更高效、可靠的circRNA单分子检测。
abcFISH实现多类型circRNA的精准单分子成像
abcFISH在多种长度与丰度的circRNA上均展现出稳定的单分子检测能力，不仅可检测circSPECC1(4)与circCDYL(2)，还能识别传统方法难以成像的短片段circASPH(2,3)，并对低丰度靶标实现精确量化。其结果与qPCR标准曲线高度一致，证明abcFISH具备可靠的定量精度，是circRNA空间分布研究的高效工具。
abcFISH实现多靶标与异构体级别的定量circRNA成像
abcFISH可在单细胞内同时成像多种circRNA，且定量结果与FPB和qPCR高度一致，并能通过RNase L介导的降解实验反映circRNA的动态变化。其还能区分同一基因座的多个circRNA异构体，并在不同细胞系中呈现一致的定位与表达差异，结果与RNA-seq完全吻合。
整体上，abcFISH以高灵敏度和特异性实现多靶标、异构体层面的单分子定量成像，为circRNA的空间功能研究提供有力工具。
图2 abcFISH实现circRNA降解监测与可变环化检测
abcFISH实现circPOLR2A的体内精准成像
在KI小鼠中，abcFISH可在脑、心、肾等多组织中高特异、无背景地成像circPOLR2A(9,10)，并结合EGFP实现体内环化效率定量。其环化率在不同组织间差异明显（心脏~7.69%，肾脏~20%），支持由反向重复序列驱动的高效环化机制。同时，肾脏各肾单位结构亦呈现显著的空间异质性。
总体而言，abcFISH能在体内实现高灵敏、空间分辨的circRNA单分子定量，为circRNA空间生物学研究提供重要工具。
图3 体内abcFISH显示circPOLR2A(9,10)在不同组织间呈现异质性表达
海马细胞类型中circPOLR2A(9,10)的异质表达及调控
利用abcFISH结合KI小鼠，研究发现circPOLR2A(9,10)在海马细胞类型间呈显著异质性：CPE细胞表达最高，少突胶质细胞最低，且环化效率与组织水平一致。单细胞RNA结合蛋白（RBP）分析显示多种反向剪接相关RBP（如HNRNPK、DDX5、TARDBP）在高表达细胞中富集，提示circRNA的细胞类型特异性可能由RBP组合协同调控，而非单一因子决定。
图4 CircPOLR2A(9,10)的表达受细胞类型差异与RBP组合效应的潜在调控
海马区域中circRNA呈现显著空间异质性
多重abcFISH显示不同circRNA在海马各亚区及细胞类型间分布差异明显：circAnks1b偏核定位、Cdr1as主要胞质且在CA1最为富集，并显著高表达于神经元而非小胶质细胞，反映circRNA在海马中具有区域与细胞类型特异的表达格局。
图5 abcFISH揭示体内内源性circRNA的表达异质性
Cdr1as与Cyrano在神经元胞体共定位
abcFISH成像显示，Cdr1as与Cyrano在海马CA1区主要分布于神经元胞体，树突中信号较少。单细胞定量进一步发现，Cdr1as在Cyrano高表达细胞中显著富集，两者在初级神经元中的丰度呈显著正相关，支持Cyrano通过miR-7途径稳定Cdr1as的模型。
图6 单分子circRNA成像揭示Cyrano是Cdr1as表达量的正向调控因子
ds-circRNA减少AD小鼠海马星形胶质细胞浸润
在5×FAD阿尔茨海默病模型中，AAV递送的ds-circPOLR2A(9,10)与ds-circCAMSAP1(2,3)能显著降低海马区GFAP信号，分别减少38%与16.4%的星形胶质细胞浸润，相比EGFP对照组呈明显减炎作用，表明ds-circRNA具有体内抗炎潜力。
图7 递送双链circRNAs（ds-cRNAs）可减少海马区星形胶质细胞的浸润
总结
该研究开发的 abcFISH 是一项稳健、高特异性的 circRNA 单分子成像技术，可在细胞与组织层面实现定量且可多重的检测，系统揭示 circRNA 的空间异质性、细胞类型特异表达及分子互作，为 circRNA 的定位研究、功能解析及疗效评估提供了强有力的技术支撑。
在 RNA 疗法领域，abcFISH 具有三方面关键价值：
（1）递送效率与定位评估：可在组织尺度精确显示治疗性 circRNA 是否成功进入靶细胞及其细胞内分布，有助于优化载体设计、剂量及给药策略；
（2）关联治疗 RNA 与局部生物效应：能够同时可视化 circRNA 与蛋白（如 GFAP）或其他 RNA，在单细胞分辨率下解析治疗机制，这是传统测序方法无法实现的；
（3）助力个性化与机制导向的 RNA 药物开发：其高空间解析能力可揭示不同细胞类型对治疗性 circRNA 的差异性响应，为精准 circRNA 药物的开发与机制研究提供关键洞见。
原文链接：
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.11.16.688740v1