肺腺癌（LUAD）是最常见的非小细胞肺癌（NSCLC）类型，其在东亚尤其是中国的发病率较高。转移约占癌症相关死亡原因的90%，即使是早期T1a/b/c期和N0/N1期的肺癌患者，也经常经历复发和转移，但缺乏预测转移的标志物。环状RNA（circRNAs）是一类不编码蛋白质的RNA分子，对RNA酶降解具有抵抗能力、半衰期长、具有组织和细胞特异性等特点，故是一类理想的生物学标志物。
工程化外泌体表现出良好的靶向能力和生物相容性；tLyp-1修饰工程外泌体能够高效地将治疗性核酸特异性地递送至癌细胞，这为针对癌症的基因递送提供了可靠的平台。
近日，温州医科大学附属第一医院王瑜敏教授团队在Materials Today Bio上发表研究论文：TLyp-1-modified exosome–mediated delivery of circRAPGEF5 ASO inhibits lung adenocarcinoma metastasis via regulating the miR-570-3p/SPP1 axis。
该团队开发了tLyp-1 修饰工程化外泌体（EXO）包装circRAPGEF5反义寡核苷酸（ASO），该工程化外泌体在体内和体外均能高效靶向肺腺癌细胞，并通过 miR-570-3p/SPP1 轴抑制肺腺癌进展。裸鼠尾静脉转移模型实验结合苏木精-伊红染色和生化指标显示tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO可显著抑制肺腺癌转移，未对重要器官造成生物学损伤。该研究阐明了tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO抑制肺腺癌转移的机制，表明circRAPGEF5可作为肺腺癌转移的新干预靶点。
tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO制备与表征
该研究首先合成了tLyp-1肽（CGNKRTR）以实现外泌体靶向，将tLyp-1肽连接到外泌体膜的表面；通过在293F细胞中的瞬时表达，生成了单体链霉亲和素（mSA）展示的外泌体。链霉亲和素–生物素系统促进HA 标签 tLyp-1肽附着到 mSA 展示的外泌体上；circRAPGEF5 ASO及其对照被装载到tLyp-1修饰的外泌体中。实验结果显示无论是tLyp-1的修饰还是 circRAPGEF5 ASO的装载都没有显著改变外泌体的形态和颗粒尺寸；tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO在生理环境中高度稳定。在PBS中，tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO核酸药物释放在2小时达到11%，随后趋于平稳，在24小时达到约95%。
图1 工程外泌体的构建与表征
tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO在体内外的肿瘤靶向及货物递送
与对照组相比，在共聚焦显微镜下观察到经tLyp-1修饰的外泌体在共同培养4小时和12小时后显示出更高荧光强度。RT-qPCR分析显示tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理组circRAPGEF5的表达水平显著降低。DiR标记外泌体在两周后通过尾静脉注射肿瘤负荷小鼠模型给药后，使用活体成像显示：与未修饰外泌体相比，tLyp-1修饰外泌体在肿瘤部位积累显著增加及滞留时间延长。
图2 工程外泌体在体内和体外的肿瘤靶向研究
tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO 体外抗肿瘤效果
细胞学实验显示tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理后显著降低了肺腺癌细胞株的增殖、迁移、侵袭能力。WB显示tLyp-1-EXO递送circRAPGEF5 ASO降低了A549和HCC827细胞中上皮-间质转化（EMT）标志物N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达水平。
图3 工程外泌体的体外抗癌作用
circRAPGEF5 ASO通过miR-570-3p/ SPP1抑制LUAD进展
通过多个miRNA网站发现识别circRAPGEF5的潜在多个miRNA靶点，实验发现circRAPGEF5可能仅与miR-570-3p相互作用；通过双荧光素酶报告实验显示circRAPGEF5野生型质粒与miR-570-3p模拟物共同转染显著降低了荧光素酶活性；结果表明circRAPGEF5可以直接结合miR-570-3p。双荧光素酶实验显示miR-570-3p mimic与SPP1野生型质粒共转染可降低肺腺癌细胞的荧光素酶活性。实验表明circRAPGEF5敲低通过解除circRAPGEF5对miR-570-3p的海绵作用，从而降低SPP1的表达水平，抑制LUAD进展。并在circRAPGEF5 ASO的工程外泌体与LUAD细胞共培养证实了这个现象。
图4 circRAPGEF5作为miR-570-3p的海绵促进了肺腺癌（LUAD）的进展
tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO 体内抗肿瘤效果及生物安全性评估
动物活体成像显示体内转移模型tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO在体内抑制了 LUAD 的转移。接受PBS或tLyp-1-EXO-NC 处理的裸鼠肿瘤增长迅速，并发出强烈的荧光，但在tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理组中，检测到的生物发光区明显较小，生物发光强度也更弱；tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO处理组的结节数量和大小以及对正常肺组织的损伤程度均显著减少。
在将人正常肺上皮细胞分别与PBS、tLyp-1-EXO-NC和tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO孵育24小时后，未观察到细胞活力的显著变化。苏木精-伊红（H&E）染色显示心脏、肝脏、脾脏和肾脏组织在所有处理组（包括PBS组和两种外泌体处理组）中均未见明显结构损伤；与PBS组相比，tLyp-1-EXO-NC或tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO组天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、尿素（UREA）和肌酐（CRE）水平未表现出显著变化；这提示tLyp-1外泌体circRAPGEF5 ASO在体内外均具有良好的生物安全性。
图5 tLyp-1-EXO-circRAPGEF5 ASO在体内的抗肿瘤转移作用，以及对工程外泌体在体内和体外的生物安全性评价
总结
该研究构建了载有circRAPGEF5 ASO的tLyp-1修饰外泌体，显示出在体外和体内均能有效靶向肿瘤，并抑制肿瘤转移，证实其良好的生物安全性。此外该研究阐明circRAPGEF5/miR-570-3p/SPP1信号通路在LUAD进展中的生物学作用，为LUAD的临床治疗提供了新的策略。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2590006425009871