环状RNA（circRNA）凭高稳定性与编码潜能成为RNA治疗领域研发热点。体外环化是circRNA平台核心，现有的化学合成、连接酶及核酶介导三大策略各有利弊。其中I/II型内含子自剪接环化法因高效、无需蛋白连接酶、工艺简化而应用最广，但仍受限于环化效率、内含子兼容性、序列长度、杂质或外源外显子（疤痕）序列残留导致免疫原性等问题。
2025年8月10日北京大学魏文胜团队在Nature Communications发表研究论文：Self-splicing RNA circularization facilitated by intact group I and II introns。团队开发了RNA体外环化的两种新型技术：反式剪接介导的置换内含子-外显子环化（PIET）和完整自剪接内含子介导的RNA环化（CIRC）。其中，CIRC表现卓越，无需分裂内含子即可实现高效环化，可适配各种内含子。CIRC成功环化长达12k nt的RNA序列，且不残留疤痕序列，为利用circRNA表达超大功能蛋白（如治疗杜氏肌营养不良症）及开发更安全有效的circRNA疗法和其它应用奠定了关键技术基础。
PIET策略
利用I型内含子剪接第二步（无需第一步GTP启动），通过两个独立转录的RNA组分（5′-内含子+中间体）在反式作用下环化。然而，PIET策略环化效率并未超越PIE法，可通过调节5′-内含子与中间体的比例优化效率。
图1 PIE（a）与PIET（b）环化策略示意图。
CIRC策略
鉴于PIET成功地环化了具有分裂内含子的RNA，那么完整的未分裂内含子是否也可实现类似的环化？根据假设，团队开发了CIRC策略。
CIRC策略直接使用天然、完整未切割的I型或II型内含子（无需内含子工程化），通过内含子自剪接第二步实现环化。CIRC兼容各种天然I型和II型自剪接内含子，可通过发现和筛选内含子进一步提高环化策略的性能。
图2 CIRC策略示意图。
CIRC高效环化
经过优化的CIRC策略，在环化编码eGFP、Gluc和Fluc的RNA（336-2543 nt）情况下，环化效率和circRNA产率显著高于PIE法。
此外，在温和条件下：较低Mg²⁺浓度、较低pH和较短孵育时间，相比PIE法，CIRC策略也表现出更快的环化速度、更高的环化效率和更高的RNA完整性。
图3 CIRC与PIE环化策略的比较。
CIRC突破序列长度限制
利用CIRC策略，团队成功地环化了编码全长肌营养不良蛋白（427-kDa）的长序列RNA（约12k nt），该蛋白缺陷与杜氏肌营养不良症（DMD）有关。团队还验证了该circRNA可正常表达肌营养不良蛋白。
图4 CIRC环化不同序列长度的RNA。
circRNA免疫原性较低
传统的PIE法通常在circRNA中残留外显子疤痕序列，影响circRNA的免疫原性。研究发现，CIRC策略中，在RNA序列定位和替换“NNUAA”基序（或“NNUA”）可产生无疤痕的circRNA。
研究结果显示circRNA免疫原性显著低于线性mRNA，但不同策略产生的circRNA免疫原性都较低，疤痕序列似乎对circRNA的免疫原性影响不大。
图5 无疤痕circRNA的构建和免疫原性测试。
CIRC兼容circRNA纯化策略
CIRC环化过程快速，可以缩短反应时间，最大限度减少内含子连接，使RNase R消化更有效。CIRC产生的circRNA非常适用基于RNase R便利高效的RNA纯化策略。
此外，CIRC也可兼容基于oligo（dT）的RNA纯化。虽然插入的poly(A)导致内含子活性有较小损害，但该纯化策略容易获得高纯度circRNA的能力，因此权衡后是可接受的。
图6 CIRC中RNase R或Oligo（dT）介导的circRNA纯化。
总结
研究开发了两种新型的RNA环化策略——PIET和CIRC。优化的CIRC在反应条件、环化效率、RNA完整性和适用序列长度方面，均优胜于传统PIE策略。CIRC无需分裂内含子，有利于探索自剪接内含子的多样性。CIRC策略克服了传统circRNA体外合成平台的序列长度限制，有利于拓展circRNA的应用范围，例如开发新的蛋白质替代疗法，用于治疗由大型全长蛋白质功能丧失引起的疾病，如DMD和Usher综合征。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-025-62607-y