精准的基因组编辑在生物学研究、医学研究和作物育种等各个领域都是必不可少的。规范的引导编辑系统利用逆转录酶和非靶向链（NTS）切口酶，例如nCas9-H840A或nCas 12a-R1138A，在切割位点下游进行编辑。
此前，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞团队基于Cas12a蛋白开发了环状RNA（circRNA）介导的引导编辑器（CPE）系统，实现高效精准编辑。在circRNA中串联置入靶向多个位点的多个crRNA，以及靶向多个位点的RTT-PBS序列，可引导基于Cas12a开发的引导编辑器系统在人类细胞系中同时编辑多达四个基因。
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基于CPE编辑器的开发，团队推测与规范PE编辑器相比，环状RNA介导的引导编辑器具有很大的研发潜力。然而，由于不存在在3’→ 5’方向上聚合DNA的逆转录酶，引导编辑器通常限于在其切割位点下游产生精确编辑。
近日，中国科学院遗传学与发育生物学研究所高彩霞研究团队在Nat Commun上发表文章：Circular RNA-mediated inverse prime editing in human cells。研究利用靶向链（TS）切口酶nCas9-D10A、逆转录酶和解旋酶Rep-X开发了环状RNA引导的反向引导编辑器（ciPE）系统。该系统拓宽了可编辑基因的范围，同时展现较高的编辑效率和安全性，具有作为基因治疗工具的潜力。
利用nCas9-D10A开发iPE
为了实现切割位点上游的引导编辑（反向引导编辑），团队利用nCas9-D10A替换nCas9-H840A切口酶，开发iPE编辑器。然而，iPE编辑器引导编辑效率有限，在HEK293T细胞中最大编辑率仅为8.6%。
图1 a：利用nCas9-H840A的规范引导编辑器（PE）示意图；b：利用nCas9-D10A的反向引导编辑器（iPE）示意图。
环状RNA介导的ciPE
团队假设编辑效率低可能是由于iPE编辑器内引导结合位点（PBS）的解旋效率低。许多原核基因组编辑系统和部分体外有效的系统在真核细胞中表现出较低的效率，可能由于双链DNA解旋的困难。CRISPR-Cas9卓越的基因编辑能力，在很大程度上取决于其DNA解旋能力。
环状RNA可以结合到特定的基因组区域，产生R-loop结构，调节基因表达并影响基因的各种生物学功能。此外，环状RNA的闭环结构使其对RNA核酸外切酶的降解具有抗性，从而使pegRNA的RTT-PBS组分的状态更稳定。环状RNA在稳定结合后可能有助于DNA解旋，从而增强反向引导编辑。
为解决编辑效率低的问题，团队设计了环状RNA介导的iPE（ciPE）系统，利用环状RNA的独特性质，提高反向引导编辑的效率。结果显示，ciPE编辑器显著改善了编辑效率，效率为0.1%-24.7%。
图2 环状RNA介导的反向编辑器系统示意图。
解旋酶Rep-X辅助ciPE
为进一步提高效率，研究引入了一种经过修饰的3’→5’解旋酶Rep-X辅助的ciPE系统，使其能够在更广泛的人类基因组中进行更广泛和有效的编辑。Rep-X作为辅助蛋白，进一步将反向编辑的效率提高到2.7%-55.4%。Rep-X辅助的环状RNA介导的ciPE系统拓宽了引导编辑的范围，并提高了以前难以靶向的基因组位点的效率。
图3 使用Rep-X辅助的ciPE增强反向引导编辑。
使用Rep-X辅助的ciPE编辑疾病靶点
在乳腺-卵巢癌疾病基因突变靶点BRCA1和Leber先天性黑朦基因突变靶点RPE65中，Rep-X辅助的ciPE系统分别实现了13.3%和9.5%的反向引导编辑效率，显著优于PAMless PE和twinPE系统。
Rep-X辅助的ciPE编辑器在疾病靶标BRCA1的编辑纯度达到96.7%，远高于PAMless PE编辑器。此外，基于nCas9-D10A的反向引导编辑器的脱靶效应较低，产生更少的副产物。这表明，基于D10 A-Cas9和环状RNA的Rep-X辅助ciPE系统具有更高的精确度，应用安全性也更高。
图4 使用Rep-X辅助的ciPE、PAMless-PE和twinPE在HEK 293 T细胞中BRCA1和RPE65疾病位点的引导编辑效率的比较。
总结
环状RNA介导Rep-X辅助的反向编辑器ciPE系统，扩大了可编辑的基因范围，提高了以往难以靶向编辑的基因组位点的效率，并显示较高的编辑纯度和较低的脱靶效应。Rep-X辅助的ciPE系统将作为规范PE系统的补充，使其能够在更广泛的人类基因组中进行更广泛和有效的编辑。总之，Rep-X辅助ciPE系统在以往难以靶向编辑的位点上，在编辑效率、精确性及安全性方面均展现出显著优势，有望成为疾病模型构建和基因治疗的有力工具。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-025-59120-7