无义突变是指由于基因突变，基因序列中出现提前终止密码子（PTC），导致蛋白质截短和功能障碍，无义突变占疾病相关突变的20%以上。例如，BRCA1或BRCA2基因中的无义突变与乳腺癌和卵巢癌风险增加有关[1]，肿瘤抑制基因TP53无义突变导致三阴性乳腺癌耐药性[2]。
作为一种内源性蛋白质，作用于RNA的腺苷脱氨酶（ADAR）负责细胞内RNA的特异性修饰，可将腺苷（A）转化为肌苷（I），随后在细胞翻译机制中被识别为鸟苷（G）。与DNA编辑相比，RNA编辑以可逆和可控的方式调控基因表达。ADAR还在多种癌症中过表达，内源性ADAR和设计的招募RNA（arRNA），为修复无义突变提供了一种更安全且可行的方法。
此前，北京大学魏文胜课题组开发了LEAPER技术（Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing of RNA）[3]，后续升级为LEAPER 2.0[4]，利用AAV将工程化的环状ADAR招募RNA（circ-arRNA）递送到非人灵长类动物及人源化小鼠体内，实现了长期、高效和精准的RNA碱基编辑[5]。
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近日，郑州大学张开翔、梁燕团队联合中国科学技术大学Xucong Teng团队，在Journal of the American Chemical Society期刊上发表研究论文：RNA Editing-Mediated Correction of TP53 Nonsense Mutations via Lipid Nanoparticle-Delivered Circular ADAR-Recruiting RNAs。研究利用优化的脂质纳米颗粒（LNP）递送设计的Circ-arRNA，显著提高了编辑效率和特异性，在乳腺癌小鼠模型中成功修复了TP53-W53X无义突变，恢复了p53蛋白的表达和功能，提高了乳腺癌对Nab-PTX治疗的敏感性，同时体现了Circ-arRNA较好的安全性。研究证明Circ-arRNA可作为纠正疾病中无义突变的有效且安全的工具，具有癌症等疾病治疗应用的潜力。
circ-RNA LNP的合成
环状RNA（circRNA）因其闭环特性而具有较高的稳定性，研究采用自剪接的I型内含子（Anabaena pre-tRNA来源）策略，通过体外转录（IVT）合成Circ-arRNA。研究采用FDA批准的D-Lin-MC 3-DMA、DOPE、胆固醇和DMG-PEG 2000的脂质制剂合成了LNP，并对配方进行优化，用于递送Circ-arRNA。
CircRNA的细胞内稳定性
LNP递送的Circ-Gluc mRNA在6天内表现出更高的细胞内表达稳定性，半衰期延长至约4天（约为未修饰的线性Gluc mRNA的3倍）。将RNA在不同的室温孵育时间转染到细胞中，circ-RNA的RT半衰期约为8天，而修饰的线性RNA的半衰期小于4天。总之，Circ-RNA LNP可以维持细胞内高水平的Circ-RNA。
图1 用Circ-Gluc mRNA、修饰的和未修饰的线性GLuc mRNA转染后的发光强度。
Circ-arRNA LNP增强TP53-W53X 4T1细胞中无义突变修复
超过50%癌症中出现导致功能丧失或致癌性增加的p53突变，TP53-W53X是肿瘤中发现的TP53无义突变的重要类型，特别是在三阴性乳腺癌中。TP53-W53X突变产生一种截短的、无功能的p53蛋白（会被迅速降解）。
图2 Circ-arRNA和ADAR介导，通过纠正TP53-W53X无义突变，恢复全长p53蛋白表达。
研究构建含有c.154 A > G突变TP53 CDS序列的乳腺癌4T1细胞，产生稳定表达TP53-W53X 4T1的模型，以验证Circ-arRNA LNP的编辑效果。施用Circ-arRNA LNP后1天，编辑效率为44.3%。与线性-arRNA LNP相比，Circ-arRNA LNP恢复更持久和更高水平的p53蛋白，编辑效率提高了4.4倍。此外，Circ-arRNA LNP的修复效果比用于抑制突变的常用治疗药物G418的修复效果更显著。
图3 H：通过Circ-arRNA和Line-arRNA LNP恢复的p53蛋白表达。I：通过Circ-arRNA和Line-arRNA LNP恢复的p53蛋白表达；J：通过Circ-arRNA LNP和氨基糖苷类药物G418的p53蛋白恢复的流式细胞术分析及K：p53蛋白的恢复。
Circ-arRNA序列编辑靶向性优化
为进一步提高编辑的特异性，研究Circ-arRNA在引入50 nt的柔性polyAC RNA接头（AC50）、A-G错配、GU摆动配对或删除A配对核苷酸等优化，显著减少了脱靶效应，其中A配对核苷酸缺失具有较好的性能。优化后的Circ-arRNA在三阴性乳腺癌TP53-W53X 4T1细胞中，LNP递送优化的Circ-arRNA，其突变校正效率达73.32%。
图4 Circ-arRNA序列优化示意图。AC50：50 nt的柔性polyAC RNA接头；AG：A和G错配；AΔ：与A配对的核苷酸缺失；G U：GU摆动配对。
Circ-arRNA的安全性评估
RNA测序结果表明，优化后的Circ-arRNA-AΔ4 LNP不诱导显著的脱靶效应或破坏内源性ADAR的正常A to I编辑，也不破坏正常的选择性剪接过程。研究中，Line-arRNA导致免疫相关基因RIG-I和MDA5水平显著增加，而Circ-arRNA-AΔ4导致RIG-I水平略有增加，表明一定程度的免疫原性。Circ-arRNA的自剪接残留序列可能导致RIG-I的上调。但Circ-arRNA-AΔ4不干扰ADAR的表达。
图5 E：RT-qPCR检测免疫原性基因。F：RT-qPCR检测ADAR亚型的相对mRNA水平。
PS：吉赛生物基于PIE法的专利环化技术circPrecise®可提供无多余序列残留的精准circRNA体外合成服务，有助于降低circRNA的免疫原性，提高circRNA的功能性。
Circ-arRNA LNP恢复p53功能活性
Circ-arRNA LNP处理后，TP53-W53X 4T1细胞凋亡和细胞毒性均以剂量依赖性方式增加。与单独使用2 μM化疗药物Nab-PTX的相比，Nab-PTX和Circ-arRNA LNP联合处理将Nab-PTX的LC50显著降低至约0.5 μM，并显著增加了凋亡和死亡细胞的比例。
图6 Circ-arRNA LNP恢复p53蛋白功能活性。
TP53-W53X的体内无义通读和抗肿瘤治疗功效
在小鼠模型肿瘤内注射circ-arRNA LNP后，无义突变得到有效校正，TP53 mRNA编辑效率在处理后24小时为48.48%，24小时后p53蛋白表达显著增加。
在TP53-W53X 4T1细胞建立荷瘤小鼠模型的肿瘤内注射施用circarRNA LNP，并通过尾静脉注射施用Nab-PTX。Nab-PTX治疗导致中度肿瘤抑制作用，而用Nab-PTX和Circ-arRNA LNP联合治疗有效抑制抑制肿瘤生长。Circ-arRNA LNP的应用对小鼠体重、器官组织学、肝肾功能、血液学没有明显的毒性影响，对ADAR亚型的组织水平无显著影响。
CircarRNA LNP和Nab-PTX的联用激活了细胞凋亡途径，显著促进肿瘤细胞凋亡。circ-arRNA LNPs处理后挽回的p53 的抗肿瘤活性，显著提高了Nab-PTX的治疗敏感性，并且具有良好的生物安全性。
图7 TP53-W53X突变的体内修复，并增加无义突变肿瘤小鼠对Nab-PTX的敏感性。
结论
研究开发了Circ-arRNA LNP系统，用于RNA编辑介导的无义突变校正。通过对arRNA的环化和序列优化，显著提高了其编辑效率和特异性。研究利用Circ-arRNA LNP成功拯救了TP53-W53X乳腺癌细胞和荷瘤小鼠模型中无义突变，显著增强了肿瘤的化疗敏感性。研究展示了Circ-arRNA LNP系统介导RNA编辑修复无义突变在癌症疾病治疗应用中的潜力。
原文链接：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c17920
参考文献：
[1] Hu, Z.Y. et al. Identifying Circulating Tumor DNA Mutation Profiles in Metastatic Breast Cancer Patients with Multiline Resistance. EBioMedicine 2018, 32, 111−118.
[2] Scata, K. A. et al. P53, BRCA1 and breast cancer chemoresistance. Adv. Exp. Med. Biol. 2007, 608, 70−86.
[3] Qu L, et al. Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nat Biotechnol 2019, 37(9):1059-1069.
[4] Yi Z, et al. Engineered circular ADAR-recruiting RNAs increase the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol 2022, 40(6):946-955.
[5] Yi Z, et al. Utilizing AAV-mediated LEAPER 2.0 for programmable RNA editing in non-human primates and nonsense mutation correction in humanized Hurler syndrome mice. Genome Biol. 2023, 24(1):243.