PNAS | 斯坦福大学Howard Y. Chang教授详解环状RNA疫苗诱导强效细胞免疫

circRNA可能作为免疫系统的调节作用已被很多文献报道。由于其共价闭环结构和没有5‘帽或3’polyA尾巴、比线性RNA更稳定，且可通过细胞外囊泡从细胞中释放出来。这些特征可作为诊断和预后生物标志物，应用于临床实践，从而越来越引起了人们的关注。

最近，作为疫苗的候选者，circRNA开发成的疫苗被证明可以在非人类灵长类动物中诱导对SARS-CoV-2的广谱保护^[1]。然而，circRNA在体内识别、翻译和激活信号导致保护性免疫的机制目前尚不清楚。

首先确定了circRNA在体内传递时的生物分布。在circRNA免疫前后，用Luminex先天细胞因子面板分析血清。将circRNA偶联到荧光团AF488上，并皮下注射（s.c.）AF488-circRNA到C57BL/6小鼠。免疫24小时后，通过流式细胞术分析引流腹股沟淋巴结（iLNs）中的先天免疫细胞亚群。结果发现，circRNA在单核细胞、树突状细胞和一些巨噬细胞亚群中被检测到。巨噬细胞亚群包括边缘脊髓巨噬细胞（MCMs）、边缘窦巨噬细胞（MSMs）和囊膜下窦巨噬细胞（SSM），其中circRNA显著富集于MCMs和MSMs。尽管小鼠中B细胞没有检测到circRNA，但B细胞频率显著增加，CD86上调检测B细胞激活也增加，并且单核细胞的频率和激活显著增加，所有巨噬细胞和树突状细胞亚群的激活也显著增加，血清中的炎症免疫因子对circRNA免疫的反应也较为强烈。综上所述，circRNA注射到小鼠体内时，诱导几种先天免疫细胞激活，同时诱导炎症细胞因子产生强烈反应。

树突状细胞（DCs）是最有效的抗原呈递细胞，负责抗原加工和呈递、迁移和T细胞共刺激。作者发现，circRNA可诱导树突状细胞的成熟，从而增加了共刺激分子的表达和多种炎症细胞因子和趋化因子的分泌。

作者使用优化的元件来进行circRNA（编码circRNA的鸡卵清蛋白-circOVA）的设计和转录，从而为了使得circRNA翻译效果超过mRNA。体外细胞实验表示，circOVA具有翻译能力。

作者使用CART递送circRNA，这是一种合成的可降解材料，可以在细胞内复杂、保护和高效地递送mRNA和circRNA，从而导致高效的蛋白质翻译。CART-circOVA转染结果表明，由circRNA编码的蛋白质可以被树突细胞加工并呈现给免疫系统。

随后作者单独用CART、circRNA或CART-circRNA免疫小鼠，结果发现CART传递的circRNA导致了先天免疫亚群的激活谱，这与之前观察到的circRNA相似。

接下来，作者试图确定circRNA和CART的组合是否可以推广到其他候选疫苗。流感病毒是突变最快的病毒之一，针对病毒保守位点（如核蛋白）的CD8 T细胞已被证明对异亚型流感感染具有保护作用。因此，作者构建了一个编码流感病毒（PR8株）核蛋白（NP）序列的circRNA，称为circNP。结果发现，circNP+CART（CART-circNP）腹腔注射后，在血液中诱导核蛋白特异性T细胞反应。结果表明，利用circRNA编码病原体来源的抗原序列可以有效地诱导抗原特异性CD8 T细胞应答。

在小鼠治疗方案中作者测试了circRNA疫苗的抗肿瘤疗效。B16-F10-OVA黑色素瘤细胞接种在小鼠的背部皮下构建肿瘤模型，然后被随机分为两组：对照组（未治疗）和CART-circOVA（疫苗）组。与未治疗组相比，circRNA疫苗组具有明显的肿瘤生长抑制作用。结果表明，circRNA免疫可作为有效抑制肿瘤生长的免疫治疗策略。