环状RNAs（circRNAs）是一种具有共价闭合环状结构的RNA分子。自从1979年首次用电子显微镜在Hela细胞的细胞质部分观察到环状RNA以来，已在不同的真核生物中鉴定出环状RNA，包括植物、真菌、小鼠和人类[1]。然而，在接下来的几十年中，由于其低丰度和非编码特性，绝大多数circRNA仍然被忽视。直到2012年借助高通量测序技术的发展，circRNA被认为是普遍表达、生物保守和组织特异性RNA分子[2]。CircRNAs的多种功能包括与线性剪接竞争、miRNA海绵、与RNA结合蛋白相互作用以及翻译多肽。同时，在神经系统疾病、心血管疾病和癌症等多种疾病中发现了异常表达的circRNAs 。由于circRNAs是普遍存在且具有功能的，因此值得进一步研究细胞中circRNAs生物发生调控的精确机制。
上周，新加坡国立大学的Polly Leilei Chen教授在Nat Commun在线发表文章ADARs act as potent regulators of circular transcriptome in cancer，ADARs调节的circRNAs在多种癌症中广泛表达，显示出与癌症的高度功能相关性，研究结果表明，ADARs对环状转录组具有双向调节，并强调了RNA加工中串扰的复杂性及其对肿瘤发生的贡献。
作者为了探究ADARs在调节circRNAs中的作用，分别对EC109中的ADAR1/2进行过表达和干扰处理。随后，对处理后的样本进行测序（RNA-seq, circRNA-seq），将筛选出的37916个circRNAs与CIRI2和CIRCexplorer2比对后发现高比例重叠的circRNAs。如图1所示，在650个ADAR1和868个ADAR2调节的circRNAs中，ADAR1/2双向调节circRNAs（ARcircs），ADAR1对大约相同数量的CircRNA发挥抑制或促进作用（促进：48% vs 抑制：52%），ADAR2最有可能是CircRNA的有效抑制物，而不是增强子（促进：15% vs 抑制：85%）。而线性mRNAs未检测到相应的变化。结果表明，即使ADARs产生A-to-I的编辑，ADARs对整体基因表达没有重大影响，而可以双向调节circRNA生物发生。
图1. 干扰/过表达ADAR1/2后表达变化的circRNAs
ADARs蛋白可准确地编辑RNA分子，改变RNA的碱基使之从A变为I（将RNA的腺苷亚基转变为肌苷亚基），进而在碱基识别的过程中造成A和G的错配，A到G约占所有检测到的错配的90%。
为了探究ADARs的编辑能力对circRNAs转录调控的影响，作者使用ADARs突变体（仅缺乏编辑活性的DeAD突变体，同时缺乏RNA结合和编辑能力的EAA突变体）处理，处理后的EC109细胞进行circRNA-seq，在识别到的1073个ArcIRC中767个被认为是编辑依赖性的，306个被确定为编辑独立性的。ADARs可以通过转录组范围内的编辑依赖和/或独立机制双向调节circRNAs。
图2. ADARs突变体处理后ARcircs表达的改变
由于ADARs介导的编辑调控circRNAs生物发生的机制缺乏实验证据，作者以典型的ARcirc Circhek2为例，已有数据表明ADAR1结合峰在两侧内含子2和9中富集[3]。如图3所示，RIP实验证明ADAR1与体内鉴定的RCM之间形成的dsRNA结构的关联，ADAR1结合并编辑了位于Circhek2侧翼内含子的RCM之间形成的dsRNA结构。
作者以3个ADAR1/2促进的circRNAs（circASH1L、circANKLE2-1和circRNF114）和3个ADAR1/2抑制的circRNAs（circSYNC、CirchX34和CirchTo1）为例进行探究，发现A-to-I编辑可能通过稳定或破坏RCM之间形成的dsRNA来改变circRNA的产生。
图3. ADAR1结合并编辑Circhek2 RCM以促进Circhek2生物发生
除了顺式作用元件外，作者预测发现两个编辑位点附近的反式作用因子（TDP43和PTBP1）。RNA下拉实验（三重突变型RNA探针）证明PTBP1与突变型探针有更高的结合偏好。进一步RIP 实验证明，PTBP1与Circhek2 RCM区域的结合在ADAR1过度表达后显著增强。既编辑增强了PTBP1与Circhek2 RCM区域的结合。
如图4所示，为证明ADARs在在多种癌症类型中作为环状转录组的有效调节因子发挥作用，作者选择了五个验证的ARCIRCs，并检测了它们在MB231（乳腺癌细胞系）、MKN28（胃管腺癌细胞系）、SNU398（肝细胞癌细胞系）和HCT15（结直肠癌细胞系）中野生型或突变型ADAR1/2过度表达时的表达变化。并观察到与EC109细胞相同的ARCIRC编辑依赖或独立调节模式。作者在肿瘤及癌旁组织样本中检测到，伴随ADARs表达变化，CircheK2表达2倍的增加和减少。表明ADARs介导的circRNAs调节很可能存在于多种癌症类型中。
图4. ADARs介导的circRNA调节存在于多种癌症类型中
为了研究ARcircs在肿瘤发生中的潜在作用，针对ARcircs的反向剪切序列设计gRNAs，以便在不影响其宿主基因表达的情况下进行特异有效的敲除。敲除Circhek2、circGALK2和circSLC39A8可显著降低细胞的致瘤能力，进一步提供了体内证据，与对照组相比，EC109和SNU398细胞中的Circhek2基因敲除导致肿瘤生长率显著降低。ARCIRCs与多种类型的癌症具有功能相关性。
总而言之，通过鉴定由ADARs调控的1000多个CircRNA，作者发现ADARs可以通过编辑依赖和非依赖机制在两个方向上调控circRNAs。证明ADAR1/2可以编辑ARcircs，改变侧翼内含子内与RCM之间形成的二级结构，并增强RBP与作用位点的结合。此外，ADARS介导的circRNA调节很可能以相同的方式存在于不同类型的癌细胞中，包括乳腺癌、食管癌、肝癌、胃癌和结肠癌。这些ARcircs不仅是反向剪接的副产物，而且是影响肿瘤发生的功能分子。这些发现提高了对ADARs和circRNAs生物发生之间的相互作用及其生物学重要性的理解。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-29138-2.pdf
参考文献:
[1].Hsu, M. T. & Coca-Prados, M. Electron microscopic evidence for the circular form of RNA in the cytoplasm of eukaryotic cells. Nature 280, 339–340(1979).
[2]. Salzman J, Gawad C, Wang PL, Lacayo N, Brown PO. Circular RNAs are the Predominant Transcript Isoform From Hundreds of Human Genes in Diverse Cell Types. PloS One (2012) 7:e30733. doi: 10.1371/journal.pone.0030733.
[3]. Davis, C. A. et al. The Encyclopedia of DNA elements (ENCODE): data portal update. Nucleic Acids Res. 46, D794–D801 (2018).