随着circRNA研究的持续深入，人们不断发现在circRNA中也偶尔会存在于母基因序列不一致的情况，因此circRNA全长序列的鉴定和分析变得越来越重要。但如何才能分析和得到circRNA的全长序列呢？有没有方便的工具能直接实现这个目标？2月3日，Genomics, Proteomics & Bioinformatics杂志（IF=6.597）在线发表了南京航空航天大学宋晓峰教授团队的一项研究成果，报道一种可以分析circRNA全长的生信工具：circAST（[1]）。下面就让我们一起来了解一下这个工具的主要原理和使用情况：
circRNA与mRNA一样是从转录产物剪切形成，只是circRNA中存在下游与上游结合的反向剪切方式（BSJ），并因此形成环形序列。circRNA很多时候与mRNA的外显子是一致的，但也存在circRNA特有的剪切形式。那么本文中作者开发的circAST是如何基于转录组测序的片段化序列拼接出circRNA全长信息的？如何实现circRNA产物的定量？circAST分析circRNA的效果怎么样？与其他circRNA分析工具相比如何？
circAST是如何分析circRNA全长的？
circAST拼接circRNA全长的算法概括而言，是基于构建多重的RNA拼接图模型，从对应的转录组测序片段和基因组比对信息中拼接出全长circRNA信息，最终的找到能够解释所有测序片段的最少circRNA拼接形式组合。具体的做法如下：首先基于Tophat2将所有测序片段中携带了拼接位点的Reads分析出来，即找出确定是跳过一段基因组序列（内含子）的那些片段，这里面包含了对应的外显子边界信息。这些测序片段通过之前报道的circRNA分析工具分析出其中的反向拼接方式，构建出RNA反向拼接图（splice graphs）。传统的线性mRNA转录产物拼接算法一般对每个基因只给定一种转录拼接图（splice graphs），但circAST将每个反向拼接的产物都作为独立的splice graphs，并基于这个进行序列拼接，因此可以有效的将反向拼接事件进行准确拼接组装。
circAST将circRNA拼接过程认为是一个扩展的最小路径覆盖问题（extended minimum path cover，EMPC），该算法通过分析测序产物中最优化的拼接方式，从BSJ的两侧均分析可能的拼接路径，最终实现circRNA全长的拼接组装。（具体算法原理详见原文，如果有理解错误敬请批评指正）。
为有效的计算各种反向拼接产物的丰度，circAST用期望最大化算法（expectation maximization algorithm，EM）对各种剪切方式进行丰度计算。
图1 circAST工作原理
circAST分析circRNA全长的效果怎么样？
为测试circAST是否有效，作者将分离的成年小鼠睾丸中circRNA进行测序分析。利用circAST分析得到了3464种circRNA，CIRCexplorer2分析到3892种circRNA分子，两种工具的结果有交叉，也有不同。利用circAST工具，从3464个circRNA中共成功分析获得了2883种circRNA的全长序列和表达丰度信息。作者也进一步对这些circRNA可变剪切方式进行了统计分析和PCR后Sanger测序验证。
图2 circAST分析成年鼠睾丸circRNA （[1]）
circAST与其他circRNA分析工具的比较
circAST分析得出的circRNA丰度信息包括FPKM（fragments per kilobase million mapped reads）和TPM（transcripts per kilobase million mapped）以及circRNA全长所对应的Reads数。由于从分析的一开始就考虑到了所有测到的反向拼接事件，理论上circAST分析circRNA全长序列和丰度的信息可能会更准确。那么实际测试的效果怎样呢？
为分析circAST的效果，作者选择了多种在线数据通过circAST和不同工具进行比较，结果表明，circAST总体灵敏度可达到85.63% – 94.32%，准确性达到81.96% – 87.55%。而CIRCexplorer2的灵敏度（74.75% – 75.61%）和准确性（58.42% – 60.42%）较之低很多。
Sailfish-cir可以对同一反向拼接位点进行精确的丰度分析，但不能识别同一BSJ中不同剪切变体。作者比较分析后结果表明circAST比Sailfish-cir的定量更准确。CIRI-AS是已报道的可以分析circRNA可变剪切的工具，但对同一数据的分析结果显示，circAST能够分析得到更多的可变剪切信息。CIRI-full是另一种已报道的可以分析circRNA可变剪切的工具，通过比较PE100，PE150，PE200和PE250的测序数据进行分析，结果表明对于短读长的测序数据，circAST比CIRI-full的性能更优异，说明circAST更能适应不同测序方案。
circAST是基于外显子注释的方法，但CIRI-AS和CIRI-full不依赖于外显子注释的信息，因此circAST会丢失一些内含子来源或基因间序列构成的circRNA。CIRI-full丢失的circRNA信息往往是全长大于600的circRNA分子。CIRI-full对于读长小于600的测序数据能很好的进行circRNA的分析，并且读长越高结果越好。但circAST在短读长的测序数据分析中有一定的优势。以CIRI-full分析的数据为基准，circAST能从更短读长的测序结果中得到较好的灵敏度，PE100 的可以达到76.05%，而PE150的则可达到80.46%。
图3 circAST与其他circRNA分析工具的比较分析 （[1]）
circAST在短读长的测序数据中依然可以很好地实现circRNA全长序列的分析，这对于大家无疑是个非常好的工具。短读长的测序成本已经非常低，利用这个工具也可以在不用增加测序成本的前提下实现circRNA全长序列的分析，对于那些丰度较高的circRNA分子的分析已经足够了。
最后，circAST是免费开源的工具，下载地址：
https://github.com/xiaofengsong/CircAST
参考文献：
1. Wu, J., et al., CircAST: Full-length Assembly and Quantification of Alternatively Spliced Isoforms in Circular RNAs. Genomics Proteomics Bioinformatics, 2020.