糖尿病是一类以高血糖症为特征的代谢紊乱疾病。经常和长期存在的高血糖症可导致许多微血管并发症，包括糖尿病视网膜病变（DR），糖尿病肾病，糖尿病神经病变和糖尿病足病。高血糖症损伤的早期和主要靶点是视网膜脉管系统。最初糖尿病视网膜病变的特点表现为以下几种形态学变化，包括周细胞减少，基底膜增厚，血管通透性增加，血管闭塞和血管闭塞微动脉瘤。视网膜血管细胞主要包括周细胞和内皮细胞（ECs）。糖尿病患者和动物发生糖尿病性视网膜病变，其早期的病理特征是周细胞丢失。视网膜ECs的表型经历从正常的静止表型转变为凋亡和活跃的表型。视网膜EC功能障碍可导致血管渗透性，黄斑水肿和血管生成增加。正常的周细胞—内皮细胞“对话”对视网膜脉管系统的发育和稳态维持来说是非常重要的。异常的周细胞—内皮细胞“对话”则可导致视网膜血管渗漏，闭塞和新血管的形成。因此，基于调节周细胞—内皮细胞“对话”的治疗干预手段将预防和保护糖尿病引起的视网膜血管损伤。
来自复旦大学上海医学院附属耳鼻喉眼科医院的颜标研究团队最近于PNAS期刊（IF=9.504）上在线发表了题为“Targeting pericyte-endothelial cell crosstalk by circular RNA-cPWWP2A inhibition aggravates diabetes-induced microvascular dysfunction”的研究，该研究显示糖尿病应激上调视网膜周细胞，而不是内皮细胞中cPWWP2A的表达水平。体外研究表明，cPWWP2A充当内源性miR-579的海绵，调控Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1基因的表达，直接调节周细胞生物学功能，而通过携带cPWWP2A的外泌体间接调节ECs生物学功能，促进ECs的迁移和血管形成能力。体内研究表明，cPWWP2A过表达或抑制miR-579表达可减轻糖尿病引起的视网膜血管功能障碍。 相反，抑制cPWWP2A表达或过表达miR-579会加重视网膜血管功能障碍。这项研究揭示了周细胞和ECs “对话”的新机制，干预cPWWP2A或miR-579的表达可为治疗糖尿病微血管并发症提供治疗策略。
1. circRNA表达谱分析鉴定cPWWP2A可作为糖尿病视网膜病变的潜在调控分子
作者主要分析db/db糖尿病小鼠模型和非糖尿病小鼠的视网膜中的circRNA表达谱，其中433种上调，411种下调，再通过对比circRNA数据库，选择与circBase库记录吻合的circRNAs,从中随机筛选并qRTPCR验证，发现20种上调和下调水平最明显的circRNAs。在上调最明显的三种mmu_circ_0010536, mmu_circ_0004367和 mmu_circ_0000254，其中小鼠mmu_circ_0000254（cPWWP2A）与人同源的hsa_circ_0074837的相似性高达89%。Sanger测序和RNase R消化实验鉴定cPWWP2A属于来源于PWWP2A基因的环状RNA。链脲霉素诱发小鼠糖尿病后或者在db/db小鼠，其视网膜中cPWWP2A表达水平明显上调，而胰岛素治疗可以明显抑制cPWWP2A表达。而且糖尿病患者的纤维血管膜中的cPWWP2A表达水平也明显上调。
2. cPWWP2A与体内糖尿病诱导的视网膜血管功能障碍有关
免疫荧光染色（绿色代表血管，红色代表周细胞）证明敲低cPWWP2A表达可以明显降低视网膜血管中周细胞的覆盖水平；Evans blue实验证明与糖尿病小鼠的视网膜相比，敲低cPWWP2A表达会明显加重糖尿病引起视网膜的血管渗漏；糖尿病视网膜的重要特征包括周细胞丢失、小动脉瘤和非细胞组成的微血管。胰蛋白酶消化视网膜血管实验发现，敲低cPWWP2A表达进一步增加了糖尿病视网膜的中非细胞组成的血管、周细胞丢失和微动脉瘤的数量；ELISAs实验证明敲低cPWWP2A表达还会促进炎症因子IL-2, IL6, TNF-α, VEGF和MCP-1的分泌，加重糖尿病诱导的视网膜炎症反应。但是如果过表达cPWWP2A则出现相反的结果，起到保护周细胞免受糖尿病诱导视网膜损伤的作用。
3. cPWWP2A在体外调控视网膜周细胞功能及其与内皮细胞的“对话”
视网膜血管细胞主要包括周细胞和内皮细胞两种，与糖尿病相关的应激（如高糖、氧化应激和炎症刺激），显著上调了周细胞中cPWWP2A的表达，但未改变内皮细胞中cPWWP2A的表达水平。由于高血糖对视网膜血管损伤的影响，周细胞丢失是早期糖尿病视网膜病变的一个标志。体外实验中，周细胞暴露于高糖环境中，可以模拟体内糖尿病环境。PI染色和caspase 3/7活性测定实验表明，敲低cPWWP2A表达促进了高糖应激诱导的周细胞凋亡。
增生性糖尿病视网膜病变通常包括有害性的视网膜血管生成。正常的周细胞功能和周细胞—内皮细胞间的 “对话”对视网膜血管的稳定性和新生血管系统的成熟具有重要意义。敲低cPWWP2A表达可抑制周皮细胞标记物（(PDGF)-β, α-SMA, Desmin,和 NG2）的表达，抑制周细胞的增殖。在周细胞和人视网膜血管内皮细胞(HRVECs)共培养模型中，敲低cPWWP2A表达抑制了HRVECs募集周细胞的现象。同时在周细胞中敲低cPWWP2A表达也显著增加了内皮对大分子的通透性。
因为cPWWP2A主要分布在周细胞的胞浆，所以作者猜测cPWWP2A可能作为miRNA的海绵，调控基因表达。Ago2蛋白是RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核心成分，它将miRNA复合物与靶mRNAs结合。RIP实验证明Ago2抗体可以特异性捕获到内源性cPWWP2A；结合TargetScan预测的靶miRNAs，通过luciferase reporter实验筛选到只有miR-579可明显抑制其荧光素酶活性；同时miR-579与cPWWP2A存在共定位的现象，两者也存在多个结合位点。所以cPWWP2A很有可能作为miR-579的海绵，调节周细胞功能。
5. cPWWP2A作为miR-579的海绵，下游靶向什么基因，调节周细胞功能？
生信分析预测了angiopoietin1/occludin/SIRT1三个基因可能是miR-579的下游靶基因。Luciferase reporter实验证明miR-579与这三种靶基因的潜在相互作用。体外敲低cPWWP2A表达可以明显抑制angiopoietin1/occludin/SIRT1三个基因的表达水平；过表达miR-579进一步加重高糖应激诱导的周细胞凋亡，抑制周细胞标志物（PDGF-β, α-SMA, Desmin, 和 NG2）的表达，抑制周细胞的增殖，抑制HRVECs对周细胞的招募。而过表达cPWWP2A则会部分逆转miR-579过表达介导的这些效应。
6. 在体内cPWWP2A–miR-579–Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1轴对于视网膜血管功能障碍的影响？
应用miR-579激动剂或者敲低cPWWP2A表达都可明显抑制小鼠视网膜中Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1基因的表达。应用miR-579激动剂明显降低视网膜血管中周细胞的覆盖水平，增加糖尿病小鼠视网膜的中非细胞组成的血管、周细胞丢失和微动脉瘤的数量，明显加重糖尿病引起视网膜的血管渗漏。而应用miR-579拮抗剂则获得与之相反的结果。之前的结果已经证明敲低cPWWP2A表达可造成视网膜血管功能障碍，而当同时注射外源性miR-579拮抗剂则会抵消这血管功能障碍的负面效应。
7. 周细胞中的cPWWP2A通过什么机制影响ECs的功能和调节两者间的“对话”？
相比与非糖尿病视网膜，来源于糖尿病视网膜的周细胞和ECs中的cPWWP2A表达水平明显上调。在体外，高糖应激只会诱导周细胞，而不是ECs的cPWWP2A表达上调，提示cPWWP2A可能通过旁分泌途径进入ECs。原位杂交和荧光染色实验证明在非糖尿病视网膜的周细胞和ECs中都表达cPWWP2A，而在糖尿病视网膜中，周细胞数量减少，cPWWP2A主要在ECs中表达。有趣的是，作者发现高糖应激可以促进周细胞分泌cPWWP2A到培养基上清中，用这种上清培养ECs可促进ECs的迁移和血管形成能力。而且相比非糖尿病小鼠，糖尿病小鼠的血浆中cPWWP2A的表达水平明显上调。应用蛋白酶K, 而不是DNase I或者RNase A，降低周细胞培养基中cPWWP2A的表达水平。
胞外囊泡可能来源于凋亡小体或者细胞不断分泌的外泌体。应用外泌体分泌抑制剂—GW4869，而不是凋亡抑制剂ZVAD有效抑制从周细胞转移到ECs的 cPWWP2A的水平，提示可能是外泌体介导cPWWP2A的细胞间转移。为了排除ECs自身cPWWP2A表达的影响，高糖处理周细胞后的上清可以显著提高cPWWP2A−/− ECs的增殖、迁移和血管形成能力。但当同时加入cPWWP2A反义转录本，可以抵消促进ECs迁移和血管形成能力的效应，进一步提示周细胞分泌到上清中cPWWP2A的重要性。
参考文献
- Liu C, Ge HM, Liu BH, et al. Targeting pericyte-endothelial cell crosstalk by circular RNA-cPWWP2A inhibition aggravates diabetes-induced microvascular dysfunction. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Mar 26. pii: 201814874. doi: 10.1073/pnas.1814874116.