环状RNA（circular RNA，circRNA）具有较高的稳定性，相较于传统线性mRNA，能够支持更持久的蛋白表达，因此在RNA药物研发领域受到广泛关注。由于缺乏传统mRNA的5′端帽子结构，circRNA的翻译主要依赖内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）或IRES样元件介导，并受到多种RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）的调控。因此，系统鉴定能够促进circRNA非帽依赖性翻译的RBP，是进一步理解其翻译调控机制、优化circRNA翻译效率的重要研究方向。
近日，南方科技大学王泽峰团队与中国科学院上海营养与健康研究所魏言欢团队在Nature Communications发表了题为“Systematic screen of RNA binding proteins that enhance circular RNA translation”的研究论文。
该研究通过构建基于PUF-RBP人工招募策略的circRNA翻译调控筛选平台，系统鉴定出68个能够促进circRNA翻译的RBPs，并结合机器学习方法预测了更多潜在的翻译促进因子。进一步分析发现，不同RBP对IRES介导的circRNA翻译具有不同的促进作用，表现出IRES特异性。这些发现加深了对circRNA非经典翻译调控的认识，也为优化circRNA翻译效率及开发工程化RNA调控工具提供了新的思路。
构建circRNA翻译促进因子筛选系统
为了筛选促进circRNA翻译的RBPs，研究团队构建了双荧光素酶报告系统，通过反向剪接生成环状Fluc（cFluc）RNA，并以Rluc作为内参。同时，利用PUF结构域将候选RBP招募至circRNA，评估其翻译调控作用。以eIF4E和eIF4G2进行验证发现，两种蛋白仅在与PUF融合后才能显著促进circRNA翻译，验证了该筛选系统的有效性。
图1｜用于评估RBP调控活性的环状RNA报告系统的设计与验证
筛选影响circRNA翻译的RBP
研究团队通过整合核糖体相关蛋白与人类RBP数据集，并结合文献分析，从261个蛋白中筛选出110个候选RBP，主要涉及RNA剪接、翻译起始和核糖体生物发生等过程，并利用PUF招募系统在HEK293T细胞中评估其对circRNA翻译的影响。
结果显示，circRNA丰度与荧光素酶活性（R=0.67）及反向剪接效率（R=0.79）均呈正相关，但校正反向剪接的影响后，其与翻译效率之间的正相关关系消失。这提示部分RBP可能通过影响circRNA生成改变其丰度，因此需要区分circRNA生成与翻译效率的变化。
鉴定并分析circRNA翻译促进因子
研究团队以相对翻译效率（TE）提高≥30%为标准，从110个候选RBP中筛选出68个circRNA翻译促进因子，主要参与翻译起始、RNA加工和核糖体生物发生等过程，部分此前已被报道参与IRES相关翻译调控。
其中，15个RBP在线性RNA双顺反子与circRNA体系中的翻译促进活性呈较强正相关。大多数促进因子同时分布于细胞核和细胞质，其中27个与应激颗粒相关，12个与P小体相关。此外，PUF-RBP融合蛋白的表达未显著改变细胞质中circRNA的相对水平，提示其翻译促进作用可能并非由circRNA亚细胞定位变化引起。
图2｜促进circRNA翻译的RBP筛选
ITAF样翻译促进因子的特征及LARP7的调控作用
研究团队将68个翻译促进因子与已知IRES反式作用因子（ITAFs）比较，发现14个为已知ITAFs，其余54个为新鉴定因子，包括LARP和hnRNP家族成员。eCLIP分析显示，多数蛋白结合转录本的5′UTR和3′UTR，其中DDX3X和LARP4在已知IRES邻近区域的结合信号较多。
随后，研究团队选取LARP7进行验证，发现其可结合UBAP2、HSPA8和TMEM107转录本中的特定RNA序列。将这些序列引入circRNA报告系统后，LARP7过表达可提高翻译效率，而在CVB3-IRES体系中，引入LARP7结合序列同样能够增强翻译；敲低内源性LARP7则削弱了这一作用。这表明，通过特定RNA序列招募内源性LARP7，可促进IRES介导的circRNA翻译。
图3｜翻译促进因子通过结合内源性RNA靶标增强circRNA翻译
解析circRNA翻译促进因子的功能与序列特征
为探究RBP促进circRNA翻译的功能基础，研究团队将12种代表性翻译促进因子的N端和C端截短片段分别与PUF融合进行功能分析。结果发现，DDX21、eIF5B、RBM28和SRRM1的部分截短片段保留了翻译促进活性，NMD3、LARP7等蛋白的N端和C端片段均具有促进作用，而SKIV2L2和eIF3D的截短片段则未能保留相应活性。
进一步分析发现，仅凭已知功能结构域难以预测RBP的翻译促进活性，部分含内在无序区域（IDRs）的片段同样具有促进作用。对110个RBP进行序列聚类分析发现，翻译促进因子具有明显的序列聚集特征，提示其翻译活性可能与氨基酸序列组成有关。
图4｜已鉴定翻译促进因子的结构域分析揭示其序列相似性
机器学习模型预测circRNA翻译促进因子
基于RBP氨基酸序列特征，研究团队构建了sPLS-DA模型，以110个候选RBP为训练集，从8,420个序列特征中筛选出300个进行分析，7折交叉验证的平均预测准确率超过70%。
随后，利用该模型对1,432个人类RBP进行预测，筛选出398个潜在翻译促进因子，并选取其中8个进行实验验证，均能提高circRNA翻译效率。相关分析显示，其翻译效率与circRNA丰度呈负相关，荧光素酶活性与circRNA水平呈弱正相关，而反向剪接效率基本不变。这些结果验证了模型的预测能力，为利用蛋白序列特征预测circRNA翻译促进因子提供了新思路。
图5｜利用sPLS-DA模型预测新型circRNA翻译促进因子
翻译促进因子对circRNA的调控具有IRES特异性
为验证新鉴定的翻译促进因子是否具有IRES反式作用因子功能，研究团队构建了分别含CVB3、EMCV、HCV和CSFV IRES的circRNA报告系统，选取DDX21、eIF3D、LARP7及机器学习预测的DEK、eIF3J和PAIP2B进行验证，并以eIF4G2作为阳性对照。
结果显示，不同RBP对IRES介导的circRNA翻译具有不同的促进效果：CVB3-IRES体系中所有受测RBP均能促进翻译，其中eIF3D效果最强；EMCV-IRES体系中eIF4G2效果最显著；HCV-IRES体系中仅DDX21和DEK具有显著促进作用；CSFV-IRES体系中大多数RBP均能促进翻译。此外，eIF4G2仅能促进CVB3和EMCV IRES介导的翻译。这些结果表明，翻译促进因子具有IRES依赖性，为优化IRES–RBP组合、提高circRNA翻译效率提供了依据。
图6｜新鉴定的翻译促进因子能够增强IRES介导的circRNA翻译
总结
本研究揭示了RBP氨基酸序列特征与circRNA翻译促进活性之间的关联，并发现不同RBP对IRES介导的circRNA翻译具有不同的调控效果。同时，通过LARP7的功能验证，展示了利用特定RNA结合序列招募内源性RBP、增强circRNA翻译的可行性。这些发现加深了对circRNA非帽依赖性翻译调控机制的认识，也为优化circRNA翻译设计提供了新的思路。
从circRNA翻译调控机制的探索，到circRNA药物研发与临床转化，基础研究的不断突破正推动环状RNA领域持续发展。如何推动前沿科研成果走向实际应用，也成为当前领域关注的重要方向。
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原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41467-026-77614-w