4月2日，Molecular Cell杂志在线发表了一篇有关RNA降解的文章，介绍发现一种m6A介导的RNA降解机制。m6A识别蛋白YTHDF2结合靶分子，并募集HRSP12，进而介导RNA内切核酸酶RNase P/MRP复合物切割靶分子。这一过程可作用于mRNA和circRNA。文章的通讯作者是韩国高丽大学的Yoon Ki Kim[1]。
circRNA的降解是认识其功能和表达方式的重要一环，但相关机制的认识还非常有限。本文的模型表明基于m6A识别蛋白YTHDF2的降解作用不仅对线性的mRNA有效，也能对circRNA有效，大大增进了对circRNA降解机制的认知。文章从YTHDF2，HRSP12和RNase P/MRP复合物的相互作用鉴定开始，分别对各个成分进行RNAi干扰，分析它们相互作用及对靶分子降解速率的影响，YTHDF2截短突变表明其N端的100aa是介导其与HRSP12和RNase P/MRP复合物结合的关键区域，最后基于CLIP等技术分析了YTHDF2和HRSP12结合靶分子的特异性，并证明circRNA也是该体系的重要靶分子[1]。下面就让我们一起学习一下本文的内容：
YTHDF2，HRSP12和RNase P/MRP复合物相互作用鉴定
已有文献报道酵母的YTHDF2同源蛋白Pho92与Mmf1（HRSP12的同源蛋白）存在相互作用，在另一项研究中预测到HRSP12可以与RNase P/MRP复合物的亚基POP1存在相互作用的可能。CoIP实验证明了人类细胞293T中YTHDF2，HRSP12和POP1确实存在相互作用，并且RNase A消化并不能抵消它们之间的相互作用，因此三者的相互作用是蛋白之间的作用，并不是由RNA介导的。进一步，体外GST融合标签Pull-down实验，Far-Western实验进一步验证了三者的相互作用。HRSP12的siRNA实验进一步表明，HRSP12是介导三者相互作用的中间桥接分子。此外，作者也在CoIP实验中验证了此前报道的YTHDF2相互作用蛋白CNOT1，且YTHDF2与CNOT1相互作用不依赖于HRSP12。
图1 YTHDF2，HRSP12和POP1相互作用（[1]）
YTHDF2，HRSP12和POP1参与m6A介导的RNA降解
由于上述的相互作用复合体中包含了内切核酸酶组分，这一相互作用是否介导了RNA的降解作用？基于SON和PLAC2基因所构建的mini基因报告系统可用于研究m6A修饰相关的过程，将其中的m6A修饰位点突变后可分析突变对于对应转录产物的影响。利用该模型，作者分析了分别干扰YTHDF2，HRSP12和POP1对报告基因转录产物的表达丰度影响情况，结果表明YTHDF2，HRSP12和POP1分别干扰后均能增加对应转录产物的丰度，延长这些分子的半衰期。有趣的是不论野生型还是突变型的报告基因，干扰均可增加其丰度。糖皮质激素受体通路可介导mRNA的降解（Glucocorticoid Receptor (GR)-Mediated mRNA Decay，GMD），HRSP12也是该RNA降解作用途径中的一个分子，那么本文所发现的这个机制与GMD通路是否一致？还是全新的RNA降解途径？地塞米松是已知的糖皮质激素衍生物，可直接诱导GMD作用，但地塞米松处理并不能增加m6A介导的报告分子降解作用。干扰POP1也不能下调GMD作用。HRSP12的敲除细胞系中回补表达野生型FLAG-HRSP12及P105A/R107E两种突变型基因的结果表明，两种突变型并不能恢复GMD作用，但可以恢复m6A介导的报告分子降解。因此m6A介导的RNA分子降解机制与GMD是不同的通路。
图2 YTHDF2，HRSP12和POP1参与m6A介导的RNA降解作用（[1]）
YTHDF2的N端100aa介导与HRSP12的相互作用
为弄清楚YTHDF2与HRSP12相互作用的位点，作者构建了截短突变体及基于MS2的β-6bs报告载体，将MS2序列融合于β-6bs报告分子的3’-UTR，MS2识别蛋白分别于不同的YTHDF2截短突变体或SMG5融合，这样可以借助MS2及其识别蛋白强制将靶分子募集于β-6bs报告分子的3’-UTR，通过分析β-6bs报告分子的丰度可监测相关分子是否具有促进靶分子降解的作用。在HAP1细胞中过表达SMG5或YTHDF2均能显著降低报告分子的丰度，但在HRSP12-KO的HAP1细胞中，过表达YTHDF2不能加速报告分子的降解，这表明在该模型中能够有效的分析m6A介导的基于YTHDF2和HRSP12的RNA降解作用。
CoIP和Pull-down实验表明YTHDF2的N端100aa是介导其与HRSP12相互作用的关键区域。在HRSP12-KO的HAP1细胞中分析其功能，结果表明只要YTHDF2的N端100aa缺失的载体均没法恢复RNA降解的作用，因此YTHDF2的N端100aa是介导其与YTHDF2相互作用及m6A介导的RNA降解作用的关键区域。
图3 YTHDF2的N端100aa是介导与HRSP12相互作用的关键 （[1]）
HRSP12和RNase P/MRP与YTHDF2的结合导致其结合的RNA分子不稳定
之前有研究报道基于RIP-seq和PAR-CLIP Seq分析了Hela细胞中被YTHDF2结合的分子。基于这些研究基础，可将全转录组中的基因分为四大类：没有被YTHDF2结合分子（Non-targets，3905个），仅在CLIP实验中捕获的（CLIP-IP组，1974个），CLIP组富集的分子（CLIP组，3250个）和同时在CLIP和RIP实验中捕获的（CLIP∩IP，1276个）。在Hela细胞中分别在分别干扰YTHDF2，HRSP12或RNase P/MRP组分，基于上述分组绘制各组的累积分布函数曲线（cumulative distribution function）。结果表明，HRSP12和RNase P/MRP与YTHDF2的结合导致其结合的RNA分子不稳定，表现为已知的可与HRSP12结合的RNA分子分布丰度总体增加，半衰期延长。
图4 干扰YTHDF2，HRSP12或RNase P/MRP导致YTHDF2结合的RNA分子增多（[1]）
HRSP12结合位点分析
HRSP12也是一种RNA结合蛋白，该分子结合RNA的motif是怎样的呢？是否与YTHDF2结合的m6A 修饰有重叠？为此，作者利用PAR-CLIP实验分析了HRSP12这些转录组中结合RNA的位点及分布情况。PAR-CLIP测序表明HRSP12结合RNA的区域与YTHDF2分布比较类似。按照HRSP12与YTHDF2分别捕获的分子分类，全转录组中的基因可分为四组：HRSP12与YTHDF2均不能捕获的（Non-targets），HRSP12能捕获但YTHDF2不能捕获的（H-Y），HRSP12不能捕获但YTHDF2能捕获的（Y-H），HRSP12与YTHDF2均能捕获的（H∩Y）。分别干扰YTHDF2，HRSP12或RNase P/MRP组分及CNOT1后分析各组的累积分布函数曲线。结果表明全转录组中，可被HRSP12或YTHDF2结合的RNA分子在分别干扰YTHDF2，HRSP12或RNase P/MRP组分时降解速率减慢。
图5 HRSP12结合分子降解状态分析 （[1]）
HRSP12结合位点和RNase P/MRP切割位点分别位于YTHDF2识别位点的上游和下游
PARE-seq（parallel analysis of RNA ends sequencing）可以分析内切核酸酶的切割位点，借助这一技术，作者分析了YTHDF2识别位点，HRSP12结合位点及RNase P/MRP切割位点的分布情况。结果表明HRSP12结合位点和RNase P/MRP切割位点分别位于YTHDF2识别位点的上游和下游。YTHDF2和HRSP12协同促进相互结合RNA分子，并促进基于RNase P/MRP的RNA内切和降解。
图6 YTHDF2，HRSP12结合位点及RNase P/MRP切割位点分析（[1]）
circRNA也可以通过YTHDF2- HRSP12介导的RNase P/MRP复合物结合并降解
YTHDF2结合的分子中也包含circRNA分子，作者挑选了其中的三种分子进行了分析：cMATR3，cFAM20B和cSLC45A4。结果表明这些circRNA分子可以通过YTHDF2- HRSP12介导的RNase P/MRP复合物结合并降解。
图6 circRNA可通过m6A介导降解作用 （[1]）
本文主要探讨YTHDF2- HRSP12介导的RNase P/MRP复合物结合并降解靶分子RNA的机制，是RNA降解作用机制的重要补充。并且验证了该机制在circRNA降解中的作用，对于circRNA表达和降解动态变化相关的机制认识有重要参考意义。
参考文献：
1. Park, O.H., et al., Endoribonucleolytic Cleavage of m(6)A-Containing RNAs by RNase P/MRP Complex. Mol Cell, 2019.