环状RNA（circRNA）相比线性mRNA具有稳定性高、半衰期长、生产经济效益等诸多优势。circRNA原位蛋白质表达的能力赋予其开发为蛋白替代疗法的潜力，特别是对于合成/储存成本高、体内半衰期短的蛋白质。
近日，陆军军医大学连继勤等人团队连发两篇研究论文，团队从基因导向性酶前体药物治疗 （GDEPT）、联合免疫细胞因子（IC）和免疫检查点抑制物（ICI）治疗的不同策略，研发了基于环状RNA蛋白替代的抗肿瘤创新疗法，验证了环状RNA蛋白替代治疗平台的优势和潜力。
（一）自杀基因疗法
基因导向性酶前体药物治疗 （GDEPT） 因其较低的全身毒性，成为了一种有前景的抗肿瘤策略。然而，自杀基因递送的挑战阻碍了GDEPT的临床转化。
陆军军医大学连继勤研究团队在Mol Cancer Ther上发表研究论文：Intratumoral administration of engineered circRNAs encoding cytosine deaminase-uracil phosphoribosyltransferase (CDUPRT) and IL-15 elicit superior antitumor efficacy[1]。
研究设计并合成了分别编码胞嘧啶脱氨酶-尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（circCDUPRT）和IL-15的工程化circRNA，并利用LNP包封递送至体内。瘤内给药后，circCDUPRT实现了持续的瘤内表达，全身毒性极小。circCDUPRT联合前药5-氟胞嘧啶（5-FC），在体外和体内肿瘤模型中均显示出显著的抗肿瘤功效。在晚期黑色素瘤模型中，circCDUPRT/5-FC联合表达IL-15的circRNA（circIL），可有效增强CD8+ T和NK细胞的扩增和激活。
这些结果表明体外合成的circRNA是高效且成本效益良好的基因递送平台，可有效应用于GDEPT和免疫治疗。
（二）免疫疗法
联合免疫细胞因子（IC）和免疫检查点抑制物（ICI）疗法的临床转化因晚期恶性肿瘤复发、全身毒性以及高昂的研究和合成成本而受到限制。
陆军军医大学连继勤、邹全明、杨明珍等人团队在Cell Rep Med上发表研究论文：Local delivery of IL-15 and anti-PD-L1 nanobody by in vitro-transcribed circILNb elicits superior antitumor immunity in cold tumors[2]。
该研究优化PIE策略构建了circCV-B3载体，实现无痕circRNA的产生，并开发生物素-亲和素纯化系统（BAPS）以提高circRNA纯度。研究设计并体外合成共编码白介素15（IL-15）和anti-PD-L1纳米抗体（Nb）的环状RNA circILNb，强效诱导冷肿瘤的抗肿瘤免疫，效果显著优于蛋白治疗药物。
circILNb的设计与构建
研究通过优化PIE环化策略，实现了无痕circRNA的体外合成：将T4td I型内含子的连接位点隐藏在circRNA序列的突变CBB3 IRES中，以避免引入外源T4td E1E2序列。二级结构预测验证突变对IRES的正确折叠影响可忽略不计。研究将该构建体命名为circCV-B3。circCV-B3具有较高的环化效率（90%），并保留了PIE系统的优点，可以根据医学应用目的作为插入CDS的载体，最大限度地减少了合成和设计成本，为circRNA的翻译应用提供方便的平台。
团队认为环化位点的连续序列是circRNA中唯一存在的序列，针对该序列下拉RNA可能是提高circRNA纯度的最优方法。因此，团队开发了生物素-亲和素纯化系统（BAPS），通过特异性探针拉下环化位点以高效去除杂质，获得接近100%纯度的circRNA。团队表示，BAPS系统具有净化效率高、成本低、处理量大等优势，但BAPS法仍未成熟，探针、反应条件、circRNA变性和空间位阻等方面仍需进一步设计和优化。
在circCV-B3载体的基础上，团队设计并合成了共编码IL-15和anti-PD-L1 Nb的circILNb，通过BAPS纯化circILNb，并将其包封在LNP中，以研究circILNb用于抗肿瘤治疗的潜力。
图1 circILNb的构建
circILNb卓越的抗肿瘤疗效
小鼠模型中瘤内注射（i.t.）circILNb实现了原位蛋白表达，诱导肿瘤中原有的CD8+T细胞和NK细胞的扩增和激活，产生了强大的局部抗肿瘤效果。此外，树突状细胞（DC）负载circILNb并迁移到肿瘤引流淋巴结（tdLN），circILNb对tdLN和肿瘤中的肿瘤特异性CD8+T细胞进行重新编程，并通过扩增CD8+T细胞，诱导强大的全身抗肿瘤免疫反应，有效抑制远端肿瘤生长。LNP-circILNb显著增强晚期肿瘤抑制效果，并克服对Nb的耐药性，证实了circILNb作为非基于蛋白质的肿瘤免疫治疗策略的可能性。此外，该研究结果表明，相比蛋白质药物（临床应用的N-803 plus αPD-L1和临床前研究阶段的N-809），circILNb展现更好的抗肿瘤疗效。
图2 原位 i.t. 注射circILNb抑制各种晚期冷肿瘤。
图3 circILNb比N-803+αPD-L1具有更强的抗肿瘤能力。
总结
该研究设计了circCV-B3载体和BAPS纯化策略以制备无痕circRNA。在circCV-B3载体的基础上，团队设计了共编码IL-15和anti-PD-L1 Nb的circILNb。瘤内注射circILNb有效抑制肿瘤生长，与传统的蛋白质疗法相比具有更好的疗效，显示了circRNA介导的原位药物表达平台的优越性。研究为IC和ICI联合应用于冷肿瘤免疫治疗提供了基于circRNA的创新治疗策略。
原文链接：
[1] https://aacrjournals.org/mct/article-abstract/doi/10.1158/1535-7163.MCT-25-0356/766658/Intratumoral-Administration-of-Engineered-circRNAs?redirectedFrom=fulltext
[2] https://www.cell.com/cell-reports-medicine/fulltext/S2666-3791(25)00486-0?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2666379125004860%3Fshowall%3Dtrue